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微生物谷氨酰胺转胺酶分离提取及稳定性研究

柏俊华  
【摘要】:谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase,R-谷氨酰胺酰-肽γ-谷氨酰胺酰基转移酶,EC 2.3.2.13简称TGase)是一种硫醇酶,通过催化蛋白质分子内或分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间连接、以及蛋白质分子内谷氨酰胺酰胺基的水解,提高蛋白质功能性质、改善结构,提高蛋白质营养价值。Ca~(2+)依赖型的TG酶广泛存在于真核生物体内,具有很多生物学功能;原核生物TG酶在放线菌中发现,属于Ca~(2+)非依赖型。 微生物发酵生产的TG酶在生理学上的地位还不太清楚,不过,其在食品加工和蛋白质改性方面的应用逐渐得到人们的重视。但到目前为止TG酶还未得到广泛使用,主要的原因有:酶活收率不高,酶稳定性低,不利于长期保存。日本味之素公司利用微生物发酵生产TG酶,同时研究了蛋白部分水解物对TG酶的稳定作用。国内生产的TG酶,酶活收率低,只接近味之素公司产品的1/10。本研究旨在提高酶液分离处理时的收率,以及生产和贮存过程中的稳定性,为TG酶的广泛使用提供基础。 本文就提高TG酶分离的收率和酶液在贮存过程中的稳定性进行了研究,并讨论了TG酶热稳定性的机理。(1)使用Grossowicz比色法测定分离提取过程中每步获得的TG酶活力;同时利用Folin酚法测定酶液的蛋白质浓度。通过计算酶活收率和酶的比活力,对超滤和乙醇沉淀步骤进行了研究。(2)通过计算不同保护剂复合的酶在高温热处理后酶活残留率的方法,比较几种保护剂对TG酶稳定性的作用。(3)利用热重(TG)/差式扫描量热(DSC)技术,分析当保护剂存在时TG酶的热力学数值的变化,包括变性温度(Tm)、热焓(AH)和热失重。 通过本研究获得的结果:(1)TG酶分离提取过程中几个关键步骤的最适条件:发酵液下罐后,经8层纱布过滤除去菌体,选用截留分子量10000的超滤膜超滤,超滤浓缩倍数2.5至3倍之间时效率最高。将超滤后的酶液pH值调节到7.5至8,加入体积为酶液体积1.5倍的冷乙醇沉淀,酶活收率达到85%左右。(2)保护剂对TG酶稳定性的保护作用比较:加入海藻糖,酶活残留率提高35%;蔗糖加入后,酶活残留率提高30%;加入葡萄糖后,酶活残留率提高25%左右。加入脱脂乳,酶活残留率提高50%;加入乳清粉后酶活残留率提高近40%。(3)利用TG/DSC分析热稳定作用的机理:纯酶的Tm值为123℃,加入保护剂后,Tm值最高可以达到155℃;纯酶的AH为17.9 J/g,加入保护剂后AH最高达到58.4 J/g;纯酶失重率为35%,加入保护剂后,失重率最低为28%。 结论:(1)TG酶在分离提取时获得的酶活收率和酶的比活力大小与处理过程中的关键步操作条件密切相关。超滤的浓缩倍数决定了超滤时间、超滤后酶液的酶活和蛋白质浓度。乙醇沉淀前pH值和乙醇加入量对产品的收率和外观有直接影响。(2)使用有机溶剂沉淀TG酶时,乙醇比丙酮更适合作为沉淀剂,因为乙醇无毒、易获得、


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