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海洋微生物多样性以及抗枯草芽孢杆菌XB16菌株初步研究

宋志刚  
【摘要】:自从Fleming发现青霉素以来,相继已有350多种抗生素应用于临床,使许多传染性疾病得到了控制。但是,由于抗生素的广泛使用,产生了大量的耐药菌株,再加新的病原菌的出现,人们必须不断开发新的抗生素。 陆地微生物资源曾是抗生素的主要来源。但随着陆生生物资源的不断开发,发现新的抗生素的几率越来越低,难度越来越大,从而带来了对新资源的强烈需求。海洋独特的环境,使海洋生物具有生物物种多样性、基因多样性、代谢机制的多样性和代谢产物的多样性,被誉为“天然药物的资源宝库”,海洋已成为世界各国开发新型药物的热点领域。 我们从东海海域采集的5份底泥样品和2份海水样品中,分离得纯培养微生物菌株542个,随机选取58株发酵培养,将所有发酵菌株的16S rDNA基因扩增,并用限制性内切酶Hinf Ⅰ对PCR产物进行ARDRA多态性分析,共得到12种不同的操作分类单元(OTU)。其中OTU5和OTU7所包含的菌株分别占总分离物的32.7%、19.0%,为优势分离物。ERIC-PCR基因组指纹图分析表明,前者的19株分离物共有12种不同的指纹图类型,而后者的11株分离物有4种。结果显示,东海海域的海水和底泥具有明显的微生物物种多样性特征。 XB16是从东海底泥中分离到的一株弱嗜盐菌,最适盐度为2.5%,经琼脂扩散法抗菌模型筛选表明对枯草杆菌有强烈抑制作用,复筛抑菌活性仍不丢失。利用PCR的方法扩增了XB16的16S rDNA,然后进行核苷酸序列测定分析。结果表明XB16与Bacillus相似性高达99%,初步确定Bacillus的一种。 对XB16菌株的发酵条件进行了研究,结果发现,XB16菌株在菌龄48h,发酵时间为100h,发酵培养基初始pH值为6.0-7.0时活性最强;最适发酵温度为25℃;振荡频率130r/min、发酵培养基配方为蛋白胨4%、酵母提取物4%,牛肉膏10%,葡萄糖10%。最适摇瓶发酵条件是:种龄48h、接种量6%、摇瓶装量60ml/250ml三角瓶、发酵温度25℃、初始pH6.0、培养时间100h。 对XB16菌株产生的抗菌活性产物的理化性质进行了初步探讨。研究表明,在强碱或者强酸条件下不稳定,在pH1.0、pH10和pH13时活性完全丧失,而在弱酸和中性条件下稳定;该抗生素具有较强的热稳定性,发酵液经80℃处理1h,其活性没有明显的下降。活性物质易溶于乙酸乙酯、甲醇,不溶于石油醚、氯仿。 采用纸片法和生物自显影法,生物活性跟踪分离全过程;应用有机溶剂对发


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