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NR2B慢病毒载体构建和病毒生产

杨馨  
【摘要】:[目的] NMDA受体由NR1和NR2两种亚单位构成。其中NR2亚单位负责调控NMDA受体离子通道的开闭。在成年动物的前脑区域(包括皮层、海马、杏仁体等)只有两种NR2亚单位能与NR1组合构成NMDA受体,即NR2B和NR2A。离体实验中NR1/NR2B复合体的EPSP持续时间明显比NR1/NR2A复合体长。NR2B亚基在动物幼年阶段表达量最高,随着动物个体的生长发育,NR2B的表达量逐渐降低。这与NMDA受体介导的EPSP持续时间的下调是相一致的。大量实验数据证明,NR2B亚单位与哺乳动物的突触可塑性、学习记忆、痛觉和神经系统疾病有关。 但到目前为止,对NR2B的研究主要在啮齿动物如小鼠和大鼠中进行。因此有必要建立NR2B转基因高等动物模型,以进一步研究NR2B亚单位在学习记忆和神经系统疾病中所扮演的角色,在本课题中,我们拟克隆人NR2B基因的全长编码序列cDNA,然后构建NR2B慢病毒载体,并生产NR2B慢病毒颗粒,从而为下一步转基因高等模式动物提供条件。 [方法] 1.采用巢式PCR,自行设计引物扩增人NR2B基因的全长编码序列cDNA。2 采用DNA重组技术,对已克隆NR2B序列中存在的突变做纠正。3 采用DNA重组技术,构建NR2B慢病毒载体。4.采取脂质体共转染的方法,在293T细胞中生产慢病毒。5.采取超速离心的方法,对收获的慢病毒颗粒进行浓缩和纯化。6.采取抗生素筛选稳定细胞克隆的方法测定病毒滴度。


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