亚甲蓝光化学法灭活血浆中丙型肝炎病毒的分子生物学机理

【摘要】： 输血是现代医学不可或缺的重要支撑手段，但输血也存在一定的风险，特别是经输血传播HIV、HBV、HCV等病毒感染的风险。输血相关病毒感染因其涉及面广且预后不良，具有较大的社会负面影响。克服病毒性输血风险，保障输血安全已成为医学界乃至全社会关注的焦点。 由于血液制品病毒标记物检测在方法学上的局限性以及病毒窗口期的存在，目前还不能万无一失地剔除携带病毒的血液或血液成分制品，因此仅依赖血液筛查的手段不能完全杜绝通过输血传播病毒的风险。以阻断病毒通过输血途径传播为目的的血液成分病毒灭活技术被认为是提高输血安全性的一道重要的屏障。对血液成分病毒灭活方法及其机理的研究是输血医学研究的热点之一。 亚甲蓝光化学方法(methylene blue photochemistry，MB-P)目前已成功应用于临床用单袋血浆的病毒灭活，其有效性和安全性已被充分验证，但该方法灭活病毒的分子生物学机理尚不十分明了，与此有关的研究还在继续深入之中。阐明亚甲蓝光化学法病毒灭活的机理将有助方法学的改进，并为其它病原体灭活方法的研究提供理论参照。 本研究选择丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)作为MB-P病毒灭活机理研究的实验对象，主要是因为HCV是我国输血后感染的最主要病原体之一，在影响输血安全的诸因素中占有较大的权重，且该病毒的感染活性目前尚无法用体外细胞培养的方法或除黑猩猩之外的动物模型感染方法予以验证，证实MB-P方法对HCV的灭活的效果，具有十分重要现实意义。同时HCV作为脂质包膜RNA病毒，可较贴切地阐明MB-P对此类病毒的灭活的机理，有助于体现相应的理论参考价值。 本研究运用PCR和荧光定量PCR技术对MB-P处理后HCV RNA的降解情况进行了研究，并对HCV RNA的降解与HCV RNA结构变化之间的关系进行了初步的探讨。 本实验室的前期研究表明MB-P处理能引起HCV NS_5基因区段的降解。在此基础上，针对全长HCV基因组序列，本题选择了一段相对保守的长度为844bp的5’-NCR(5'-non-coding region)及相邻的核心区(core region，C区)基因片断，以及一段长度为973bp的NS_2基因片断作为研究对象。通过MB-P处理前后不同时间点留样，对这两个区段RNA进行RT-PCR检测及荧光定量PCR检测。结果表明：在MB-P处理早期，血浆中的HCVRNA迅速降解，在处理20分钟内从5.5×10~5copies/ml降低到8.2×10~3copies/ml，而在处理后期降解趋势逐渐缓慢，在处理60分钟后可检测到的核酸量降低到2.8×10~3copies/ml。整个过程中HCV RNA以对数模式降解。实验结果验证了病毒核酸是MB-P灭活的靶目标之一。 为了揭示除核酸以外的病毒构件及病毒蛋白成分在MB-P灭活过程中的作用，本研究设计了体外转录HCV RNA的灭活实验。构建了分别插入HCV 5’-NCR和C区基因、NS_2基因片断的2个重组质粒，鉴定后进行体外转录试验。将体外转录的HCV RNA分别用代血浆(羟乙基淀粉20—氯化钠注射液，HES20)和PBS缓冲液稀释至与血浆所含病毒相近的浓度(≥10~5copies)，在无除核酸以外的病毒构件及病毒蛋白成分的条件下进行与前述实验条件相同的MB-P处理。结果发现，体外转录HCV RNA在MB-P处理下依然能发生降解，在处理20分钟内可检测到的核酸量从3.2×10~5copies/ml降低到6.2×10~4copies/ml，处理60分钟后降低至2.0×10~4copies/ml，表明MB-P方法能直接作用于核酸，使核酸发生降解从而达到病毒灭活的目的。同时，血浆中病毒的核酸降解速率明显快于HES20和PBS中的体外转录HCV RNA，提示除核酸以外的某些病毒构件或蛋白可能会影响MB-P对HCV RNA的作用效率，相关的研究尚有待进一步展开。 实验研究首次证实MB-P能有效降解HCV-RNA 5’-NCR+C区及NS_2区基因片断，表明：1)亚甲蓝能直接作用于病毒核酸，在光照条件下降解病毒核酸使病毒灭活；2)MB-P处理下，HCV RNA的浓度呈对数形式下降；3)该方法对体外转录HCV-RNA的降解效率相对低于对血浆中HCV-RNA的降解效率。