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盘基网柄菌细胞差异表达基因的研究

张敏  
【摘要】: 盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)是一种低等的真核原生生物,在营养丰富的条件下以阿米巴单细胞形式吞噬细菌为食,行二分裂方式繁殖生长。一旦食物匮乏,单个细胞聚集成多细胞体,细胞历经细胞丘、蛞蝓体、拔顶阶段完成发育和分化过程,最终形成由孢子细胞和柄细胞组成的子实体。在合适条件下,孢子细胞萌发开始新生命周期。盘基网柄菌为了保证发育进程和保持细胞聚集体的完整性,在发育的不同阶段表达了特定的细胞粘附分子。饥饿的盘基网柄菌进入多细胞发育期时,在发育早期会表达粘附分子gp150,粘附分子gp150调节的细胞与细胞间的粘着影响了细胞丘“突出”的形成,由此影响了盘基网柄菌多细胞发育的形态发生.盘基网柄菌与后生动物有许多共同的细胞生理生化反应,如胞浆移动、吞噬作用、趋化性、信号转导以及一些发育事件如细胞分类、模式形成和细胞类型决定等。盘基网柄菌属单倍体基因组仅34Mb,包括六条染色体和线粒体DNA,每条染色体大小4Mb-8Mb,大约有11000个基因。尽管它们是真核生物中最简洁的基因组之一,但是其基因与高等生物的基因有高度相似性。与哺乳动物基因相比,盘基网柄菌基因中内含子出现频率少,长度一般都仅100-200bp,外显子中A+T含量约77%,内含子及其邻近区域中的A+T含量超过90%,这种碱基组成上的双峰分布是盘基网柄菌DNA的一个突出特点,加之内含子的两端都有规范的剪接位点,使之能很容易地从内含子及其临近区域中区分出外显子;这样预测的基因结构就有很高的可信度。因此盘基网柄菌可作为一种模式生物来研究细胞类型的分化及其相应基因功能。 本实验以Kax-3野生型细胞和AK127突变型细胞为材料,剥夺食物触发多细胞的发育后,野生KAX-3细胞经历趋化性聚集、细胞丘形成和蛞蝓体阶段最后形成子实体,发育顺利完成。而突变AK127细胞由于不能表达gp150蛋白,尽管发育早期细胞趋化性聚集,但到疏松聚集阶段发育停滞下来,细胞的分化被锁住,最后细胞解聚。gp150为细胞丘内的形态发生建立一个粘附微环境,同时它也参与调节细胞类型专一化和分化的信号途径。gp150是一种细胞表面膜蛋白,它作为粘附分子,推测介导细胞之间的信号传递,调节细胞内部的酶促反应,开启发育所需基因的表达,进而推进发育进程。突变AK127多细胞发育停滞,在基因表达上必然与野生型KAX-3细胞存在差异。gp150介导的信号途径影响了哪些发育所需基因的表达,以及这些基因在盘基网柄菌发育中的作用正是本论文的主要研究内容。 采用mRNA差异显示法来分析盘基网柄菌野生型KAX-3细胞与突变型AK127细胞在多细胞发育阶段基因的表达差异。提取细胞发育重要阶段(发育后12h、116h)的两种细胞总RNA,反转录合成CDNA第一链,进行不同锚定引物与任意引物组合的差异显示。琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到两种细胞间存在明显的差异表达条带。选取特征性的差异条带,进行回收,克隆,酶切和鉴定。最终Northern杂交检测,D12A,D16B和d16a为阳性片段。片段测序并运用NCBI数据库系统对这3个片段分别进行核苷酸序列同源性信息查询。并用RACE-PCR对d16a进行5‘—端末端扩增,以期得到一条完整的基因。 分析结果表明:D12A跟恶性疟原虫3D7的虚拟蛋白的mRNA有部分相似,但是同源性很低,估计该片段可能是一个新基因,而D16B跟盘基网柄菌的虚拟蛋白的mRNA高度同源,同源性高达99%,但是该基因的功能还未明。而对于它的功能我们还需进一步的研究。d16a与盘基网柄菌线粒体DNA有较高同源性,氨基酸序列比对发现它与盘基网柄菌线粒体核糖体蛋白S4(Dd-mtRPS4)有同源性。d16a代表的序列可能属于盘基网柄菌线粒体DNA上一个ORF,参与蛞蝓体阶段前孢子细胞的分化。据此我们推测线粒体在盘基网柄菌多细胞的发育中也起着重要的作用,上述数据都表明这些基因可能与盘基网柄菌的发育和细胞分化有着密切的联系,这从另一个侧面反应出了gp150蛋白在盘基网柄菌的发育中有重要的作用。


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