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模拟生物膜的电化学研究

马勇  
【摘要】: 今天人们普遍认为类脂双层构成了所有生物膜的基本结构。人们公认类脂双层为生物膜的模型仅有75年左右的时间。然而,类脂双层的概念起源更早,并且可追溯到三百多年前,它是从物理学家和发明家的Hooke定律骨架开始的,Hooke于1665年提出“细胞”这个术语来描述用他原始的显微镜观察到的软木片基本结构。大约30年后,Newton估计了“最黑”皂泡的厚度为3/8×10~(-6)英寸,相当于9.5nm,这与现代测量值极其符合。皂泡中‘黑洞’的早期观察对生物膜类脂双层概念的发展及随后在双分子类脂膜(平面类脂双层和球形脂质体)的实验过程有着深远的影响。毫无疑问,这些令人兴奋的发展的灵感来源于生物界,例如,自然界使用自组装策略创造复杂的、有功能的结构,除了上述细胞膜的类脂双层,还有诸如手性蛋白质及DNA。热力学促成自组装,如果两性磷脂(例如卵磷脂,PC)分子在水中,烃链将远离含水溶液。它们将全部到达水面(像油在水中一样)或者它们能彼此相对。伴随着烃链彼此相对,磷脂两性分子能够形成两个不同的构造。一为胶束,它可以被描述为类脂极性基团在外而烃链挤到一起的小球;另一个即为类脂双层。 在20世纪60年代早期,Rudin和他的合作者们认识到在皂膜变薄的最后阶段是由一个夹在含水溶液中的两类脂单层构成。他们指出,一个水中的皂泡或者一个从脑分离物中形成的BLM,有许多类似生物膜的物理和化学性质,如被刺破可以自动密封,一旦经某些蛋白质(如涂以EIM)修饰,这个大约6nm厚、电‘惰性’的结构将被激活,展现出类似神经膜作用电位的那些特征性质。BLM体系已广泛地用于研究包括生物能、光合成、免疫学和生物传感器发展的多种物理学、化学及生物学现象。 生物膜结构的双层模型可以简单地陈述如下:所有的生物膜基本结构均由一个双分子类脂层(即一个类脂双层)及吸附其上的非类脂层(大多是蛋白质)构成。在双层的内部,烃链被伦敦范德华力结合在一起。支持双分子层模型的最有力证据是由Rudin和他的合作者们于1960年发现的平面构型的‘黑’类脂膜的形成。后来由许多研究小组开展的实验论证了双层类脂膜(BLMs)是生物膜极好的实验模型。这之后不久,Bangham发现了球形构型的类脂囊泡即球形脂质体。由于平面BLMs和球形脂质体的实用性,这使得首次研究分隔两含水溶液的超薄(~6nm)类脂双层的电性质和传输现象成为可能。因为膜的功能和结构是同一类脂双层的‘两肋’,从当前的工作来看生物膜大体的亚显微结构是:类脂以双层结构的形式为蛋白质和其他组分提供骨架,这些组分在类脂双层中是可变的。膜类脂双层实际上是可流动的而且与橄榄油有一致性(粘度约1mPa·s)。这样,类脂、蛋白质和其他组分被观察到在类脂双层范围内能够自由的伸展,在这个功能实体内,诸如受体、离子通道、色素、酶等都可被嵌入。在分子水平上,类脂和蛋白质均展示了不对称性;而细胞内部的结构也不同于外部。这是为解释膜两侧物质主动运输而必须如此。膜内酶或免疫遗传素的能动位置被发现仅在类脂双层的一侧。最后,这个动态的、流动的、不对称的类脂双层结构也能让我们洞察膜体系内各种形式的能量转化及细胞间和细胞内溶质的交换,信息和信号转化等机理。 本文简要介绍了生物膜的组成、结构和一些基本性质,详细描述了各种生物膜模型(支撑磷脂双层膜、非支撑磷脂双层膜、泡囊等等)的制备方法。概要地总结了模拟生物膜的各个领域的研究情况,着重评述了模拟生物膜在电化学、生物传感器等领域的研究进展。采用电化学、光谱学以及原子力显微镜等方法对支撑双层磷脂膜、硫醇单层膜等不同的模拟生物膜体系进行了研究。主要结果如下: 1.采用循环伏安法(CV),电化学阻抗谱(EIS),对由表面活性剂十六烷基-3-甲基溴化氨(HTABr)引起铂电极支撑的类脂双层膜电化学行为的变化以及该模拟生物膜的重新自组装行为进行了测定。实验结果表明,表面活性剂十六烷基-3-甲基溴化氨是一种有效的离子载体,其分子可以和探针分子K_3[Fe(CN)_6]/K_4[Fe(CN)_6]形成离子对,并以此来帮助K_3[Fe(CN)_6]/K_4[Fe(CN)_6]克服由于生物膜的疏水性而产生的能量障碍,进而帮助探针分子实现跨膜传递。铂电极支撑的类脂双层膜(s-BLM)的通透性随着加入表面活性剂的浓度和时间的变化而变化,所加入表面活性剂的浓度越大,与s-BLM作用的时间越长,跨膜传递到达电极表面的探针分子也越多,所产生的响应电流也越大。而且,我们发现,在一定程度内(即表面活性剂的浓度低于Csol,或反应的时间比较短),若将电极取出放入到KC1支持液中,磷脂分子在电极表面可以重新自组装,s-BLM重新恢复到原来的状态,探针分子在电极上的响应电流也逐渐变弱,直到完全消失。这个可逆的过程可以多次重复。 2.利用自组装方法在金电极表面制成硫醇单层膜(SAM),并应用循环伏安法(CV)和交流阻抗谱(EIS)对由与表面活性剂十六烷基三甲基溴化胺(HTABr)引起的硫醇单层膜电化学行为发生的变化进行了测定。结果表明表面活性剂可与硫醇单层膜相互作用并对其膜表面分子的有序结构产生影响。当吸附在膜表面以及插入膜内部的HTABr分子遇到溶液中的探针分子[Fe(CN)_6]~(3-)/[Fe(CN)_6]~(4-)时,能与其发生强烈作用并生成缔合物,因此探针分子可以很容易克服由于膜的存在而产生的能量障碍,接近硫醇单层膜到达电极的表面;与HTABr之间仅仅存在静电吸引作用的探针分子抗坏血酸,在电极表面的循环伏安响应仅有很小的增强;而与HTABr间存在排斥作用的多巴胺探针的氧化还原响应得到了一定程度的抑制;与表面活性剂没有任何作用的中性探针对-苯二酚则不受影响。这些现象的产生可能与HTABr与探针分子间的相互作用有关,即根据探针分子与表面活性剂之间的作用不同,表面活性剂修饰的硫醇单层膜对溶液中不同的探针分子有选择性的进行电化学响应。 3.利用自组装技术在铂电极上制备成支撑的磷脂双层膜(s-BLM)作为生物膜的模型,利用循环伏安法(CV),电化学阻抗谱(IES)和原子力显微镜(AFM)对由金属氧酸盐K_7[PTi_2W_(10)O_(40)]·6H_2O(PM-19)引起的s-BLM通透性的变化进行了研究。实验结果表明,K_7[PTi_2W_(10)O_(40)]·6H_2O可与s-BLM发生较强的相互作用,结果导致s-BLM表面磷脂分子的有序排列受到影响,产生了一些微孔,同时降低了s-BLM的电阻,增加了膜电容,也增加了探针分子Fe(CN)_6~(3-)/Fe(CN)_6~(4-)与电极间的电子传递。通过原子力显微镜我们可以观察到PM-19诱导磷脂双层膜产生一些孔洞,并对产生这种现象的可能的机理进行了初步的探讨。 4.采用循环伏安法(CV)和紫外-可见(UV-vis)吸收光谱,对羟基自由基引起模拟生物膜的损伤以及硒多糖对羟基自由基的抑制作用进行了研究。实验结果表明,羟基自由基能够引起模拟生物膜的损伤,进而对膜的通透性产生影响。但是在硒多糖存在时,羟基自由基的这种作用受到抑制,即硒多糖能够清除自由基保护生物膜。通过硒多糖与普通多糖,硒以及过氧化氢酶抑制羟基自由基能力的比较,我们观测到当体系中同时存在硒多糖和过氧化氢酶时,它们的自由基清除率得到了一定程度的提高,而不仅仅是各自作用的加合,说明多糖与酶之间存在着某种关系,可以相互作用进而提高它们的活性和清除羟基自由基的能力,并探讨了硒多糖清除自由基的可能机理 5.应用自组装技术在铂电极和金电极上制备成支撑的磷脂双层膜(s-BLM)和硫醇单层(DDM)膜作为生物膜的模型,利用循环伏安法(CV)、电化学阻抗谱(IES)对抗精神病药物氯丙嗪(chlorpromazine hydrochloride,CPZ)引起的模拟生物膜通透性的变化进行了研究。实验结果表明,氯丙嗪可与s-BLM和DDM发生较强的相互作用,结果导致s-BLM和DDM表面分子的有序排列受到影响,氯丙嗪可以在s-BLM上产生了一些微孔,降低s-BLM对探针分子的阻碍作用,增加了Fe(CN)_6~(3-)/Fe(CN)_6~(4-)与电极间的电子传递,同时在氯丙嗪的浓度达到一定程度时,可以将s-BLM结构完全破坏,将磷脂分子从电极表面洗脱下来。而由于DDM与金电极结合的比较牢固,因此氯丙嗪与DDM作用到一定程度后基本达到一种平衡的状态。同时对产生这种现象的可能的机理进行了初步的探讨。


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