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肝癌导向肽结合蛋白的筛选及其功能研究

汪磊  
【摘要】: 原发性肝癌是一种分布范围广、危害严重的致死性疾病,我国是肝癌高发地区,每年至少有12万人死于原发性肝癌。然而在临床上对肝癌目前尚缺乏根治性的治疗方法,究其原因主要与我们对肝癌发生、发展的机理还知之甚少,对肝癌细胞具有的特殊生物学特性及其分子机理还有待于进一步深入研究。因此加强肝癌基础理论的研究,提升有效的早期诊断和治疗技术具有重要的理论意义和实际应用价值。 本实验的前期工作是利用噬菌体展示肽库技术筛选与肝癌特异性结合的导向肽,已经建立了多种筛选方法,尤其是在荷瘤动物模型中的体内筛选技术,同时建立了一套肿瘤特异性导向肽在体内外靶向作用的鉴定技术。目前已经筛选获得了多条特异性结合于肝癌组织的导向肽,并获得了中国发明专利。本论文在此基础上,拟利用获得的三种肝癌细胞特异性导向肽(A54、WP05和JY96),通过固相生物淘洗和免疫学技术从己构建的肝癌cDNA表达文库中筛选出这些导向肽的结合蛋白基因,并分析这些基因与肝癌发生、发展之间的联系,同时通过亲和分离技术从肝癌组织蛋白提取液中分离与这些导向肽相互作用的结合蛋白。 本论文主要分成以下几个部分: 一、肝癌导向肽的体外结合活性鉴定 在前期工作中我们筛选获得了一系列能够特异性结合肝癌细胞的噬菌体肽,然而体外化学合成的肽是否还能保持这一导向特性还需要进一步验证。我们采用化学合成的方法合成了多肽WP05、JY96和A54,并对其进行羧基荧光素(FAM)标记,通过体外结合活性来验证这些导向肽与肝癌细胞的特异性结合作用。经验证,化学合成的WP05、JY96和A54肽确实能在体外与肝癌细胞特异性结合,为分离导向肽在肝癌细胞上的结合蛋白奠定了理论基础。 二、肝癌cDNA表达文库的构建及肝癌导向肽结合蛋白基因的筛选 通过cDNA表达文库筛选策略分离肝癌特异性导向肽WP05、JY96和A54的结合蛋白基因。以人肝癌细胞BEL-7402的裸鼠移植瘤为材料,构建了肝癌cDNA表达文库,原始文库滴度为6.1×10~7pfu/ml,重组率99.3%,扩增后滴度1.4×10~(11)pfu/ml,达到了用于目的基因分离筛选和克隆表达的建库要求。以生物素(Biotin)标记的导向肽为探针,同时采用固相筛淘法和免疫学方法筛选cDNA文库。实验结果显示:利用导向肽WP05从文库中筛选到了SNX27基因;利用导向肽JY96筛选到RBX1基因。 三、siRNA抑制SNX27基因表达对肝癌细胞的影响 SNX27是通过导向肽WP05从肝癌cDNA表达文库中筛选到的基因。SNX27基因在肝癌细胞内上调表达,因此我们通过RNA干扰技术分析SNX27基因与肝癌发生、发展之间的相互关系。RNA干扰采用siRNA真核表达载体的方法诱导。通过在线siRNA设计工具设计SNX27基因干扰靶序列,利用pAS质粒构建siRNA真核表达载体pAS/SNX27i。通过转染试剂将pAS/SNX27i转染到BEL-7402细胞中,分析RNA干扰抑制效率,分别检验了SNX27基因表达被抑制的肿瘤细胞在增殖、粘附和迁移的变化。结果表明,转染后SNX27基因的表达抑制效率达到了29.5%。SNX27表达抑制导致肿瘤细胞发生如下变化:增殖速率显著下降;细胞粘附性下降,与对照细胞相比差异极显著(P=0.00084<0.005);细胞迁移性下降,与对照细胞相比差异显著(0.05>P=0.0016>0.001)。 四、siRNA抑制RBX1基因表达对肝癌细胞的影响 RBX1是通过导向肽JY96从肝癌cDNA表达文库中筛选到的基因。经差异表达分析,RBX1在肝癌细胞BEL-7402中呈上调表达,提示其可能与肝癌有一定联系。构建RBX1基因的siRNA真核表达载体pAS/RBX1i,通过转染试剂将pAS/RBX1i转染到BEL-7402细胞中,检验RBX1基因表达被抑制的肿瘤细胞增殖、粘附和迁移的变化。结果表明,转染后RBX1基因的表达抑制效率达到了68.6%。RBX1表达抑制导致肿瘤细胞发生如下变化:增殖几乎完全停滞;细胞粘附性下降,与对照相比差异极显著(P=0.0003<0.005);细胞迁移性下降,与对照相比差异极显著(P=0.0007<0.005)。 四、肝癌蛋白的提取及肝癌导向肽结合蛋白的亲和分离 为分离得到肝癌导向肽A54的结合蛋白,我们尝试从肝癌组织蛋白中用亲和分离技术获得A54肽的结合蛋白。从荷瘤裸鼠模型肿瘤组织中提取肝癌组织蛋白。以Biotin-A54肽作为亲和分离介质,通过多种亲和分离技术从提取的肝癌组织蛋白中获得能与A54肽相互作用的结合蛋白。经对洗脱蛋白的质谱进行分析,发现洗脱蛋白为分子量为67kDa的一组蛋白,其中包括已有报导的潜在肿瘤膜标志蛋白HSC71。经生物信息学分析,HSC71蛋白具有能与A54肽相互作用的空间结构。 从上面的实验我们可以得到以下结论: 1.通过体外的细胞结合实验,证明了导向肽WP05、JY96和A54能够与肝癌细胞特异性结合; 2.成功构建了人肝癌细胞裸鼠移植瘤的cDNA表达文库,达到了用于目的基因分离筛选和克隆表达的建库要求; 3.利用导向肽WP05从cDNA表达文库中筛选到SNX27基因; 4.利用导向肽JY96从cDNA表达文库中筛选到RBX1基因; 5.成功构建了SNX27基因siRNA真核表达载体pAS/SNX27i,转染BEL-7402细胞后,对SNX27基因表达抑制效率达到29.5%,能够抑制肿瘤细胞增殖、粘附及其迁移。 6.成功构建了RBX1基因siRNA真核表达载体pAS/RBX1i,转染BEL-7402细胞后,对RBX1基因表达抑制效率达到68.6%,能够抑制肿瘤细胞增殖、粘附及其迁移。 7.尝试通过亲和分离方法分离导向肽A54的结合蛋白,分离得到的一组67kDa的蛋白,其中包含HSC71。HSC71具有能与A54相互作用的空间结构。


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1 汪磊;肝癌导向肽结合蛋白的筛选及其功能研究[D];华东师范大学;2007年
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