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运动对线粒体生物发生及其信号转导机制的研究

王丽  
【摘要】: 耐力运动带来骨骼肌脂肪酸氧化和线粒体密度增加,且变化具有高度特异性,其确切的调节分子机制还有待研究。线粒体发生过程需要核DNA与线粒体DNA(mtDNA)共同协调表达,调节基因组间协调表达及mtDNA转录和复制的信号通路还不是特别清楚。运动刺激线粒体生物发生,其中一个重要的生物学过程就是活性氧自由基(ROS)的产生,导致细胞氧化还原状态的变化。长期适度运动产生适量的ROS可能在运动引起的线粒体发生中发挥关键作用。另有研究提示哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路与线粒体功能之间密切联系,且mTOR通路受到细胞氧化还原状态的调节,这也许是mTOR感受营养等条件刺激及与线粒体活性间联系的潜在机制。 运动对mTOR信号的诱导作用还不完全清楚。有人认为类似耐力运动的刺激选择性激活单磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)/过氧化物酶增殖激活受体γ-辅助激活因子-1α(PGC-1α)信号通路,抗阻训练则激活蛋白激酶B(Akt)/mTOR通路,且有氧运动后激活的AMPK/PGC-1α信号可能是mTOR信号通路抑制的原因之一。但还存在许多矛盾的结论,如抗阻运动后AMPK信号通路激活,而长期有氧运动激活Akt/mTOR信号通路等。总之,目前对于运动后AMPK/PGC-1α和Akt/mTOR信号通路激活情况的认识还相当欠缺,而除了AMPK/PGC-1α信号通路之外,Akt/mTOR信号通路在线粒体发生过程中的作用也相当值得研究。 长期训练后的适应性变化被认为源自每次急性运动后暂时性变化效应的累积。目前,对于急性运动后基因特异性转录激活的认识越来越多。这种激活,在某种水平上,起到恢复和维持运动后骨骼肌稳态的作用,同时也是长期训练后骨骼肌适应性变化的基础。PGC-1α被认为在骨骼肌适应性变化的过程中发挥关键性作用。PGC-1α具有结合和影响很多转录因子的作用,调节特定细胞进程;PGC-1α还辅助激活过氧化物酶增殖体激活受体(PPAR)α和γ,调节脂肪酸摄取和β-氧化,及通过对解偶联蛋白(UCPs)的转录调节而调节解偶联呼吸;此外,PCG-1α和核受体相互作用,包括核呼吸因子(NRFs),参与多种核编码基因和线粒体转录因子A(Tfam)等的表达。转录因子Tfam、线粒体转录特异因子B1(TFB1M)及线粒体转录特异因子B2(TFB2M)与NRF-1和NRF-2关系密切,共同合作负责调节核及mtDNA编码的转录因子的表达,确保线粒体的发生。运动可以激活多种信号分了,包括AMPK,促进PGC-1α及其下游信号的表达。此外,目前研究已发现,除了PGC-1α外,耐力运动导致多种与线粒体发生和代谢有关的基因表达变化,如NRFs、Tfam、PPARα、丙酮酸脱氢酶激酶(PDK4)、脂蛋白酯酶(LPL)、肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅰ(CPTⅠ)等。 本研究的目的在于:1)探讨不同运动强度(中等强度和大强度运动)对于线粒体发生的不同影响;2)探讨mTOR信号通路在运动介导的线粒体发生中的作用;3)探讨两种急性耐力运动后骨骼肌线粒体生物发生和脂肪酸氧化相关信号基因表达的变化。 一单纯运动干预和运动联合mTOR信号抑制剂雷帕霉素(RPM)干预对大鼠线粒体生物发生的影响 方法:SD大鼠42只,所有大鼠适应性饲养一周后,进行适应性训练3天。此后进行随机分组。第一批大鼠18只实施单纯运动干预研究,分为3组:安静组(C组)、中等强度运动组(M组)和高强度运动组(H组);第二批大鼠24只实施运动联合RPM干预研究,分成4组:安静组(C组)、单纯RPM注射组(R组)、单纯中等强度运动组(M组)和中等强度运动加RPM注射组(MR组)。每组大鼠数量均为6只。 第一批大鼠M组和H组分别在1周渐增强度训练后继续2周不同强度的跑台运动,每周5次,每次1小时。C组不参加运动训练。末次运动结束48小时候处死大鼠,取骨骼肌提取线粒体检测ROS水平,同时保存部分骨骼肌样本留待检测线粒体呼吸链酶复合物(complexⅠ,ⅡandⅣ)蛋白表达及mtDNA和细胞色素氧化酶(COX)Ⅳ基因表达水平。 第二批大鼠中M组和MR组进行1周渐增强度训练后继续2周中等强度跑台运动,每周5次,每次1小时,C组和R组不参加运动训练。同时,R组和MR组注射RPM(2mg/kg体重),每周5次,每次注射均在运动前1小时完成。末次运动结束后48小时处死大鼠,取骨骼肌、脑和肝脏三种组织,分别提取线粒体检测ROS生成水平和线粒体呼吸链酶复合物(complexⅠ)活性同时冷冻部分骨骼肌样本留待检测线粒体呼吸链复合物(complexⅠ,ⅡandⅣ)蛋白表达、相关信号蛋白PGC-1α、NRF-2和磷酸化Akt(P-Ser473-Akt)表达及mtDNA和COXⅣ基因表达水平。 结果:1)第一批大鼠各组(C组、M组及H组)骨骼肌线粒体ROS及第二批大鼠各组(C组、R组、M组和MR组)骨骼肌、脑和肝脏组织线粒体ROS的生成水平相似,无统计学显著差异(P>0.05)。 2)运动联合RPM干预研究中大鼠脑、肝脏和骨骼肌线粒体M组的ComplexⅠ活性均显著增加(P<0.05)。肝脏线粒体MR组也出现了同样的变化。脑线粒体中R组ComplexⅠ活性显著下降,且M组与R组比较,存在显著差异(P<0.05)。 3)单纯运动干预研究中,ComplexⅠ蛋白表达在M组和H组显著增加,ComplexⅡ在各组没有显著变化,ComplexⅣ表现出和ComplexⅠ相似的增加趋势,但是无统计学显著差异。 4)运动联合RPM干预研究中,ComplexⅠ在M组及MR组显著增加,ComplexⅡ在所有组间无显著变化,ComplexⅣ在M组和MR组也表现出增加的趋势,但是无统计学显著差异。 5)运动联合RPM干预研究中,P-Ser473-Akt蛋白水平在M组和MR组出现同样的显著增加,PGC-1α和NRF-2蛋白水平在M组显著增加。 6)mtDNA在单纯运动干预研究没有出现显著性变化,但M组出现增加的趋势(P=-0.083),在运动联合RPM干预研究中的各组同样没有出现显著性变化,但是M组和MR组均出现增加趋势(P分别为0.08和0.095)。COXⅣ在单纯运动干预研究的M组显著增加,且和H组比较有显著差异;在运动联合RPM干预研究中,M组和MR组均显著增加。 结论:1)ROS在线粒体发生过程中发挥重要的第二信使作用,但是长期运动训练后ROS生成可能与急性运动后的变化有所不同。2周运动后安静状态下线粒体ROS生成并没有显著变化,此外,RPM单独使用或者联合运动干预也不会影响安静状态下线粒体ROS生成。 2)运动训练增加ComplexⅠ蛋白含量和活性等,增强线粒体呼吸和氧化功能。RPM抑制了脑线粒体ComplexⅠ活性及运动对ComplexⅠ活性的激活,但是在肝脏和骨骼肌组织中没有出现这一现象,提示不同组织对RPM反应的敏感程度不同。对于其它线粒体呼吸链复合物如ComplexⅡ和Ⅳ蛋白的表达,可能需要更长运动周期或者不同运动方式促使其变化。 3)耐力运动激活Akt,从而有可能激活mTOR信号通路,且RPM的使用并不能阻止运动对Akt的激活。 4)中等强度运动通过促进骨骼肌PGC-1α和NRF2蛋白表达增加促进线粒体发牛,2周后COXⅣ基因表达显著增加,mtDNA呈上升趋势,而RPM在一定程度上抑制了运动介导的线粒体发生。 二两种自行车运动对人骨骼肌线粒体发生及脂肪酸代谢相关信号基因表达的影响 方法:选取了9名无规律运动训练史的健康受试者,采用两种相同强度(60%VO_(2max))和持续时间(90min)但不同形式的运动,即持续性(Con)和间歇性(In)自行车运动,分别检测运动前(Pre)、运动后即刻(Post)及运动后3小时恢复期(3 hs Post)气体代谢、血液生化学指标及以PGC-1α为核心的一系列转录因子基因表达的变化。持续性自行车运动中,整个过程运动强度保持恒定的60%VO_(2max)的水平;间歇性自行车运动,运动强度为120%VO_(2max)持续12秒和20%VO_(2max)持续18秒轮流交替。两种运动强度相等,持续时间均为90分钟。两次运动相隔至少两周时间进行。运动前、运动中每30分钟各收集呼出气体一次分析气体代谢指标。血标本和肌肉标本分别在运动前、运动结束即刻和运动后3小时获取,用于检测血糖、血乳酸和游离脂肪酸(FFA)浓度及线粒体发生和脂肪酸代谢相关的多种信号基因的表达。 结果:1)气体代谢指标RQ、VO_2(L/min)、VO_2(ml/min.kg weight)、Vent、Vent/VO_2,及HR、RPE等,在In组和Con组均极为相似和接近。 2)血乳酸在In和Con组的Post显著升高(P<0.05),在3 hs Post时恢复到安静水平;FFA在In和Con组的Post和3 hs Post均显著升高(P<0.05)(在In组和Con组分别升高了2.7和3.3倍),且Post和3 hs Post的FFA浓度十分相似和接近;Glucose在In和Con组的Post(P<0.01)和3 hs Post均显著降低(P<0.05)。 3)Con组和In组,PGC-1αmRNA和PRCmRNA在Post均有增加的趋势(P>0.05),但直至3 hs Post才显著升高,且3 hs Post与Post间具有显著差异。PGC-1α在Con组和In组3 hs Post分别升高了4.6倍和6.9倍;PRC在Con组和In组3 hs Post分别升高了3.0倍和3.3倍。PGC-1βmRNA在Con组和In组都没有发现显著性差异。 4)NRF-1 mRNA在Con和In组均显著下降。在Con中Post和3 hs Post时间点NRF-1 mRNA分别下降了22%(P<0.05)和34%(P<0.05);在In组Post和3hs Post时间点分别下降了25%(P<0.05)和9%(P>0.05)。NRF-2只在In组中出现显著下降,Post和3 hs Post分别下降了33%(P<0.05)利26%(P<0.05);在Con组有下降的趋势(Post和3 hs Post分别下降了14%和13%),但是没有达到统计学差异。与NRF-1和NRF-2关系及其密切,负责mtDNA转录和复制的调节因子:Tfam、TFBlM和TFB2M,在Con和In组运动前后均没有发生显著性变化。 5)AMPKα1 mRNA在Con和In组运动前后没有发生显著性改变,但是AMPKα2 mRNA在Con和In组运动后均显著降低(Con组和In组3 hs Post分别降低了36%和43%),且3 hs Post与Post比较,均具有显著差异(P<0.05)。 6)PPARs家族的3个成员中PPARα和PPARβmRNA在Con和In组中均没有发生显著性变化;PPARγmRNA只在Con组的3 hs Post显著降低(下降了23%),In组没有发生显著性变化。3个成员在运动后的变化之间没有发现显著的相关关系。 7)PDK4表现出与PGC-1α及PRC十分相似的变化特点。Con组和In组Post均具有升高趋势(3.0倍和2.2倍),但无显著性差异,3 hs Post显著上升(16倍和6.7倍),且与运动后即刻比较显著差异。CPTⅠβmRNA在运动后出现下降的趋势。在Con组和In组分别下降了18%和28%(Post)及41%和21%(3 hsPost)。但是,只有Con组3 hs Post(下降41%)具有统计学显著差异。LPLmRNA在两组运动后表现出非常相似的变化趋势,Post下降(Con组和In组分别下降了9%和23%),3 hs Post稍有所升高(Con组和In组分别上升了1.06和1.14倍),但是无统计学显著差异。 8)PGC-1α和PGC-1βmRNA在Con组和In组中Post和3 hs Post的变化均具有显著的正相关关系。TFB1M和TFB2M mRNA在Con组和In组中3 hs PostmRNA的变化均具有显著正相关关系(P分别<0.01和<0.001),但是在Con组和In组Post的变化却没有出现显著相关关系。 结论:1)两种相同强度、相同时间,但不同形式自行车运动(持续性和间歇性)运动对机体造成相似的应激,对线粒体发生和脂肪酸代谢相关信号基因表达的影响间也无显著差异。 2)运动对PGC-1家族成员的调节有所不同。90分钟中等强度(60%VO_(2max))自行车运动后,PGC-1α、PRC mRNA在运动后3小时均显著增加,而PGC-1βmRNA没有变化。PDK4 mRNA的变化和PGC-1α及PRC十分相似。这些都提示急性运动可能通过激活重要的相关转录因子等促进线粒体发生和脂肪酸氧化等。 3)90分钟中等强度(60%VO_(2max))自行车运动后,NRF-1、NRF-2、AMPKα2、PPARγ、CPT-ⅠβmRNA等出现了不同程度的下降,这说明急性运动后某些基因可能受到抑制,或者至少这些基因的变化不是简单的运动后升高变化,可能存在先抑制后激活等变化特点,另外急性运动后机体的反应和长期运动带来的变化可能有所不同,甚至完全相反。 全文总结:1)2周中等强度和高强度运动虽然没有改变安静状态下线粒体ROS生成水平,但是显著增加了线粒体呼吸链复合物活性和蛋白表达。中等强度运动促进线粒体发生,与线粒体发生相关的信号蛋白P-Ser473-Akt、PGC-1α及NRF-2蛋白表达及COXⅣ基因表达显著增加,mtDNA基因表达也呈增加趋势。 2)气体代谢指标、血乳酸、FFA和血糖等指标变化在90分钟中等强度(60%VO_(2max))持续性和间歇性自行车运动干预下变化十分接近,且多种线粒体发生及代谢相关的信号基因变化也十分相似。 3)90分钟中等强度(60%VO_(2max))持续性和间歇性自行车运动后PGC-1α、PRC和PDK4均在运动后即刻呈增加趋势,结束后3小时显著升高;PGC-1β无显著变化;NRF-1、NRF-2、AMPKα2、PPARγ、CPT-ⅠβmRNA等出现了不同程度的下降,提示急性运动后线粒体发生和代谢相关的基因激活从而促进线粒体发生和增加脂肪酸动员和氧化供能,但是某些基因可能受到抑制,或者至少这些基因的变化不是简单的运动后升高,可能存在先抑制后激活等其它变化特点,也提示急性运动后机体的反应和长期运动带来的变化可能有所不同,甚至完全相反。


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