壬基酚对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）的免疫毒性及雌激素效应研究

【摘要】： 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又名河蟹,是我国极为重要的水产经济动物。随养殖规模的扩大,中华绒螯蟹病害也随之加剧,给养殖业造成了极大经济损失。自身的免疫能力下降、病原体增加以及其生存水环境污染是导致河蟹疾病的三大主要原因。其中环境因素起着重要作用,不仅影响甲壳动物机体抗病能力同时也导致病原生物的大量繁殖。 对甲壳动物来说,水体污染物引起的环境压力是其免疫力下降的一个重要原因。甲壳动物机体变化或患病率的上升可以作为环境压力的标志。目前对中华绒螯蟹的环境胁迫研究主要集中在氨氮,温度,pH值,重金属离子等环境因子方面,有关壬基酚(NP)等环境内分泌干扰化学物质对河蟹的毒性作用的研究未见报道。NP是一种常见的、化学性质稳定的,并且容易在生物体内积累的污染物。随着工业的发展,污染加剧,我国长江流域水体和沉积物中发现了NP的存在。目前已有大量研究证实NP可对生物体产生的不良作用：包括对内分泌、生殖和发育、致癌、免疫等方面。中华绒螯蟹的生存环境也受到NP的威胁,因此,有必要探索NP对水产养殖虾蟹类的胁迫效应,为建立相应的评价体系提供理论指导。 本研究借助免疫检测技术和分子生物学手段,通过对免疫相关酶活性的测定,对血细胞密度(THC)、酚氧化酶激活系统(proPO、PPAF)、抗菌肽(crustin)、抗氧化酶系统(SOD、CAT、GPX)等免疫相关基因表达量以及卵黄蛋白原(VTG)的变化的检测,分别从细胞和分子水平检测腹腔注射NP对中华绒螯蟹的免疫毒性及雌激素效应,为NP对中华绒螯蟹作用的研究丰富资料。 主要研究结果如下： 1、NP暴露10d后,中华绒螯蟹总血淋巴细胞THC密度下降,且与NP的剂量(10mk／kg～1000mg／kg)呈反比线性关系。在本实验的中剂量300mg／kgNP进行的时间效应实验中,中华绒螯蟹THC密度在腹腔注射暴露后的3d内呈下降；暴露6d后,血细胞数回升,此后血细胞数呈现明显的回升,并在第14d接近对照组。 2、较低剂量(≤100mg／kg)NP可提高中华绒螯蟹血细胞ProPO和PPAF基因的表达量,但是高于此浓度时,诱导效应反而下降。NP对中华绒螯蟹ProPO和PPAF基因表达的诱导具有时间效应,注射后6d内表达量一路上调,其后回落。 3、低剂量的NP同样可以使中华绒螯蟹血淋巴细胞抗菌肽甲壳素crustin mRNA表达的上调。经低剂量NP预暴露1d的中华绒螯蟹,感染嗜水汽单胞菌时血淋巴细胞中crustin的表达量远高于未预暴露组,但是NP暴露14d后的个体,受细菌感染时血淋巴细胞中crustin的表达量低于未感染组,显示出短时间免疫应激效应。 4、中华绒螯蟹肝胰腺超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和过氧化物酶GPX对NP暴露的感应灵敏。最低剂量(10mg／kg)的NP即可诱导酶活性的升高,并且有明显的剂量效应关系。NP对中华绒螯蟹抗氧化酶类的作用是双向的,即较低剂量的NP暴露可以显著提高酶的活性,并诱导抗氧化酶基因的表达,而较高剂量组暴露反而使得酶活性显著低于对照组,表现为抑制效应。此外,NP对中华绒螯蟹的毒性作用有时间变化过程,即呈现先缓慢上升,后下降的过程。 5、NP对中华绒螯蟹也有雌激素效应。不仅可提高雌蟹肝胰腺中卵黄蛋白原基因的表达水平,也可诱导雄性中华绒螯蟹肝胰腺VTG基因的表达。10mg／kg剂量组NP暴露就检测到了VTG基因的表达量的升高,500mg／kg表达量达到最大值。 综合分析各项实验结果可知,低剂量的NP可刺激中华绒螯蟹产生免疫应激反应,这种应激反应随NP在体内的代谢消除而减弱,并会对中华绒螯蟹的免疫能力产生一定的负效应。高浓度的NP,通过减少中华绒螯蟹血淋巴细胞影响免疫功能。与高等脊椎动物的反应相似,NP对中华绒螯蟹也有雌激素效应。