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中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)精巢vasa基因克隆与表达分析

孙江玲  
【摘要】: vasa基因是编码DEAD-box家族中一种ATP依赖的RNA解旋酶,首次报道于果蝇中作为生殖质的组成成份之一。vasa基因在已报道的绝大多数物种中仅限在生殖系细胞中表达,因此被广泛用作生殖细胞的分子标记物,主要用于配子发生和原生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)起源、迁移、分化等方面研究,因此可以认为vasa基因在动物生殖细胞发生和生殖调控中起到重要作用,但与模式生物相比,十足目关于DEAD-box家族蛋白的研究相对薄弱。 本文采用SMARTerTM RACE技术,筛选和克隆了中华绒螯蟹vasa基因全长cDNA序列。获得的中华绒螯蟹精巢vasa基因(Es-vasa)的cDNA序列长2369bp,其中开放阅读框ORF长1866 bp,编码621个氨基酸的蛋白,5’UTR(untranslated reagion,非编码区)为48 bp,3’UTR为455 bp; BlastP分析表明该cDNA推导的氨基酸序列与哺乳动物、鱼类、两栖类等脊椎动物及一些无脊椎动物(昆虫类、软体、环节、棘皮动物等)的VASA蛋白序列具有较高的相似性;Es-VASA具有DEAD-box家族蛋白共有的全部8个motif、GG重复序列和Q-motif、锌指结构(CCHC框)的VASA蛋白专有保守基序;推导氨基酸编码DEADc和HELICc两个功能域,与已经报道的物种VASA蛋白功能域一致;进一步的系统进化分析显示由该cDNA推导的VASA蛋白序列首先和节肢动物甲壳纲动物相关蛋白聚成一支,然后与其它相近物种依次聚类,证明其分类地位与进化关系相一致。上述证据表明我们获得了中华绒螯蟹vasa基因cDNA全长序列。 利用半定量RT-PCR技术和实时荧光定量Real-Time PCR技术对中华绒螯蟹vasa mRNA组织分布及发育过程表达变化进行分析,发现在两性生殖细胞(卵巢和精巢)中vasa基因mRNA转录本存在较高水平表达,在其他组织(心脏、血细胞、肝胰腺、鳃、胃、肌肉、肠、副性腺、胸神经节、脑神经节)则几乎检测不到表达信号;对其性腺各个发育阶段的实时荧光定量PCR结果显示Es-vasa mRNA转录本在性腺快速发育期表达量最高,但二者的最大表达量有差别,卵巢最高表达量高于精巢;性腺各个时期表达量均有显著性差异(P0.05)。随着性腺逐渐发育成熟,其表达量均表现出逐渐减少的趋势:卵巢表达量明显降低是在河蟹成熟前期至受精后;精巢表达量在精细胞期即出现明显下降。性腺Es-vasa表达量在配子成熟后降至最低,卵巢在稳定期的最小表达量仅为对数增长期最大表达量的约14%,精巢仅约6.25%,这与绝大多数物种生殖细胞发育阶段的表达规律相似,可能说明vasa基因功能主要在于参与性腺形成,对性腺生长作用不大。 与模式动物相比,甲壳动物生殖生理的分子机制研究相对薄弱,有关中华绒螯蟹繁殖相关研究多集中在受精生物学、发育组织学和细胞学、饵料营养等方面,对其生殖细胞发生的分子调控机制方面报道很少。中华绒螯蟹是我国主要的淡水经济水产品,在大规模人工养殖过程中出现了一系列问题,如养殖过程中出现的性早熟现象使成蟹的品质明显下降,严重制约了中华绒螯蟹的经济产值。鉴于此,我们针对已经建立的中华绒螯蟹精巢cDNA文库,从中发现在中华绒螯蟹性腺中特异表达的vasa基因,并进一步克隆得到vasa基因cDNA序列,以期进一步研究中华绒螯蟹原生殖细胞的起源、分化及其生殖调控的分子生物学机制,为虾蟹类的遗传育种提供分子生物基础理论依据。


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