收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

外源基因在集胞藻6803中高效表达及调控的研究

魏兰珍  
【摘要】: 蓝藻是一类能进行光合放氧作用的原核生物。集胞藻6803 (Synechocystis sp. strainPCC 6803)是一种单细胞蓝藻。该株系具有天然DNA转化系统,细胞结构简单,生长速度快,适应性强,是第一个完成基因组序列测定的光合生物。另外,它还能利用简单无机物合成有机物,并且表达的外源基因产物不易形成包含体。因此,利用转基因蓝藻制备基因工程药物的下游加工过程相对简化,是理想的基因工程研究的模式藻。但是,蓝藻中外源基因的表达效率低下,一直制约着蓝藻基因工程的长足发展。 本研究以增强型绿色荧光蛋白基因egfp (enhanced green fluorescent protein)作为外源基因,构建适用于插入各种调控元件的同源重组整合平台——P0载体;然后利用该整合平台,通过插入各种已知的和未知的调控元件、自然转化、继代筛选,从而获得了多种转基因株系;通过比较各种转基因株系中外源基因的表达水平,对各种调控元件进行评价,从而筛选出能高效表达蓝藻外源基因的调控元件,具体步骤如下: (1)利用P0载体,在其报告基因上游分别插入聚球藻7942中groESL基因的温度诱导型启动子以及SD序列(GGAGAG),转化集胞藻6803,得到转基因Pg和Pg-s藻株。利用蛋白免疫印迹,研究不同生长时期、不同温度以及不同诱导时间下转基因株系中外源egfp基因的表达情况。研究结果表明,处于衰退期的转基因株系中外源基因的表达水平最高;并在此生长时期下,该启动子最适宜的诱导条件是在42℃诱导30分钟。通过比较各转基因藻中外源基因的表达情况发现:添加SD序列后则使外源基因的表达水平提高了1.6倍,而含groESL基因启动子和SD序列的Pg-s藻株中外源基因的表达水平比未添加启动子的P0藻株提高了2.0倍。综上所述,在集胞藻6803中,异源groESL基因启动子和SD序列的串联可明显提高蓝藻细胞中外源基因的表达水平。 (2)利用P0载体,在报告基因上游插入聚球藻7002中cpcβ基因的光诱导型启动子,并转化集胞藻6803,获得转基因藻Pc。通过蛋白免疫印迹,研究不同光强、不同诱导时间以及不同CO2浓度对转基因株系中外源egfp基因的表达情况。结果表明:10μEm-2·s-1的光强诱导4小时后,转基因株系中外源基因的表达水平达到最高,而且低浓度的CO2也可以明显增强外源egfp基因的表达。 (3)通过基因芯片数据和生物信息学的分析,初步确定ndhC-K-J操纵子可能的启动子区域,并插入到PO载体报告基因的上游区域,转化集胞藻6803,获得转基因株系P330。通过蛋白免疫印迹,研究不同生长时期、不同高光诱导时间以及二氧化碳浓度下转基因株系中外源基因的表达情况。结果表明,该未知启动子在高光诱导4小时,低二氧化碳培养条件下,使外源egfp基因的表达水平达到最高。通过比较Pg-s与P330藻株中外源基因的表达情况,揭示ndhC-K-J操纵子可能的启动子区域对外源基因的启动效果更为显著;P330藻株中外源基因的表达水平比Pg-s藻株提高4.2倍,比P0藻株提高8.2倍;蛋白定量结果表明,在转基因P330藻株中,外源egfp基因的表达量可达总蛋白的1.725%。 本研究在构建同源重组双交换平台的基础上,分析来源于聚球藻7942的groESL基因启动子、聚球藻7002的cpcβ基因启动子、SD序列以及集胞藻6803自身ndhC-K-J操纵子可能的启动子区域对集胞藻6803中外源基因表达水平的影响。蛋白免疫印迹结果表明,这些调控元件均在一定程度提高了集胞藻6803中外源基因的表达效率,其中,ndhC-K-J操纵子可能的启动子区域对外源基因表达水平的提高幅度最大。以上结果为最终解决蓝藻细胞这一新型宿主系统中外源基因表达效率低下的问题注入了新的希望,为将来利用转基因蓝藻制备基因工程药物奠定了实验基础。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 孔任秋,徐旭东,冯勃;集胞藻的随机插入诱变和光激活异养突变株的筛选[J];水生生物学报;2001年06期
2 王永红,叶济宇,米华玲,李元广,张嗣良;集胞藻Synechocystissp.PCC6803利用葡萄糖生长与光合能量转化的关系[J];植物学报;2000年11期
3 宋凌云,施定基,宁叶,罗娜,邵宁,俞梅敏,茹炳根;用同源重组法将人肝金属硫蛋白突变体ββ基因整合在集胞藻6803中表达[J];植物学报;2001年04期
4 阎春兰;徐旭东;;集胞藻6803光合自养生长突变株的筛选与鉴定[J];水生生物学报;2009年02期
5 吴桂芳,吴庆余,沈忠耀;培养条件对蓝细菌生长及PHB积累的影响[J];清华大学学报(自然科学版);2001年06期
6 高宏;唐蜻;徐旭东;;集胞藻PCC6803铜离子诱导表达平台的构建[J];水生生物学报;2007年02期
7 阎春兰;黄惠青;;铜对集胞藻PCC6803生长的影响[J];湖北农业科学;2009年09期
8 赵瑾;常学秀;吴程;何玉芹;;Ni~(2+)胁迫对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)和集胞藻(Synechocystis sp.)的生长和光合色素的影响[J];生态毒理学报;2010年05期
9 徐旭东,孔任秋,刘珂,王江新,宁德刚;集胞藻ORFs侧翼序列的PCR扩增和定向基因插入失活策略[J];水生生物学报;2001年06期
10 王永红,李元广,施定基,沈国敏,茹炳根,张嗣良;集胞藻6803在封闭式光生物反应器中的混合营养培养[J];高技术通讯;2001年05期
11 薛红芬;周妍;骆昆;陈小兰;;AHLs及其结构类似物对蓝藻紫外防护剂生物合成的影响[J];云南民族大学学报(自然科学版);2009年02期
12 唐蜻;谈晓明;徐旭东;;集胞藻PCC6803中Ⅱ型RNA结合蛋白对于脂肪酸组成的效应[J];科学通报;2010年17期
13 阎春兰;丁华堆;;镉对集胞藻PCC6803生长的影响[J];中南民族大学学报(自然科学版);2008年04期
14 康福星;龙健;潘响亮;朱健;王倩;王立英;;集胞藻钙化对Cd胁迫的生理响应[J];环境科学学报;2008年10期
15 刁红丽;周婷;赵开弘;;集胞藻ApcA和CpcA的体内生物重组研究[J];武汉理工大学学报;2011年04期
16 解鹃;周杰;张海峰;李寅;;阻断集胞藻6803 PHB合成途径提高胞内NADPH含量[J];生物工程学报;2011年07期
17 王淑璠,李元广,李志勇,施定基,茹炳根,张嗣良;转小鼠金属硫蛋白基因集胞藻6803及其野生藻培养[J];华东理工大学学报;2000年01期
18 吴程;常学秀;吴锋;刘军燕;郑桂来;;高等水生植物对集胞藻(Synahocystis sp.)的化感作用研究[J];云南大学学报(自然科学版);2008年05期
19 施定基,张超,李世明,李次山,张芃芃,杨明丽;蓝藻与植物叶绿体光合系统基因的生物信息学研究[J];遗传学报;2004年06期
20 周丽娟;陈小兰;王波;陈善娜;;外源AHLs信号物质对蓝藻生长代谢的影响[J];云南大学学报(自然科学版);2007年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘顺梅;臧晓南;张学成;刘滨;张维芬;孙平楠;况成宏;;摄食转基因集胞藻牙鲆的安全性评价[A];中国海洋湖沼学会藻类学分会第七届会员大会暨第十四次学术讨论会论文摘要集[C];2007年
2 刘顺梅;张学成;臧晓南;刘滨;梁冰;;摄食转牙鲆生长因子基因集胞藻的大菱鲆血液指标及微核研究[A];中国海洋湖沼学会藻类学分会第七届会员大会暨第十四次学术讨论会论文摘要集[C];2007年
3 康升云;魏兰珍;王全喜;;启动子Pcpcβ提高集胞藻6803中外源eGFP表达效率的研究[A];中国海洋湖沼学会藻类学分会第七届会员大会暨第十四次学术讨论会论文摘要集[C];2007年
4 孔任秋;徐旭东;冯勃;;集胞藻的随机插入诱变和光激活异养突变株的筛选[A];中国藻类学会第十一次学术讨论会论文摘要集[C];2001年
5 杨洋;殷春涛;徐旭东;;集胞藻PCC6803 α-生育酚与耐受低温光氧化的关系[A];中国海洋湖沼学会藻类学分会第七届会员大会暨第十四次学术讨论会论文摘要集[C];2007年
6 高宏;徐旭东;;集胞藻PCC6803中Vipp1蛋白功能的重新探讨[A];中国海洋湖沼学会藻类学分会第七届会员大会暨第十四次学术讨论会论文摘要集[C];2007年
7 王建林;陈思礼;赵开弘;;集胞藻PCC 6803 apcD基因的定点突变及体内重组研究[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第八届第十七次学术年会论文汇编[C];2007年
8 杨洋;殷春涛;徐旭东;;集胞藻(蓝细菌)PCC6803生育酚与耐受低温光氧化的关系[A];第二届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文集[C];2006年
9 张莉华;陈思礼;赵开弘;;集胞藻PCC 6803 apcE定点诱变[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第八届第十七次学术年会论文汇编[C];2007年
10 郭正红;魏兰珍;王全喜;;groESL启动子提高集胞藻6803中外源egfp基因表达效率的研究[A];庆祝中国藻类学会成立30周年暨第十五次学术讨论会摘要集[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前6条
1 魏兰珍;外源基因在集胞藻6803中高效表达及调控的研究[D];华东师范大学;2010年
2 张晓雯;蓝藻信号转导系统的比较基因组学分析及重要基因功能的验证[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2008年
3 刁红丽;集胞藻藻胆蛋白降解的蛋白酶研究[D];华中科技大学;2011年
4 董妍玲;鱼腥藻PCC7120外膜蛋白的鉴定及功能研究[D];中国科学院研究生院(水生生物研究所);2007年
5 刘金姐;节旋藻藻蓝蛋白操纵子、Rubisco基因及节旋藻和螺旋藻分子系统学研究[D];中国海洋大学;2003年
6 陈李萍;蓝藻PGR5-CET的生理功能研究[D];华东师范大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 龙宗娟;集胞藻6803中一个未知基因的功能分析及其自然转化条件的优化[D];上海师范大学;2010年
2 高梅;集胞藻PCC6803基因slr0280调控机制的研究[D];华中科技大学;2009年
3 高梅;集胞藻PCC6803基因slr0280调控机制的研究[D];华中科技大学;2009年
4 邵明洋;系统分析集胞藻PCC6803未知蛋白功能[D];天津大学;2012年
5 王建英;集胞藻6803中slr0815的功能分析[D];上海师范大学;2013年
6 秦春燕;寻找集胞藻PCC6803中S2P蛋白酶底物的研究[D];华南理工大学;2013年
7 李晴冬;集胞藻PCC6803中未知蛋白与四吡咯色素蛋白的初步研究[D];华中农业大学;2013年
8 张治宇;集胞藻6803中两个同源新基因在盐胁迫下的应答研究[D];上海师范大学;2012年
9 钟罗宝;集胞藻PCC6803中EGY1同源基因slr0643和sll0862的功能初探[D];华南理工大学;2010年
10 陈金灶;蓝藻光合系统电子传递蛋白(Fd)突变体的初步研究[D];厦门大学;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978