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氨基酸脱氢酶AADH的结构与机理研究

李箭  
【摘要】:来自梭菌属Candidatus Cloacamonas acidaminovorans的3,5-二氨基己酸脱氢酶(AADH)是一种NAD(P)依赖酶,能够可逆的催化3-羰基-5-氨基己酸(3-keto-5-aminohexanoate)还原胺化成(3S,5S)-二氨基己酸((3S,5S)-diaminohexanoate,(3S,5S)-DAH)。野生型酶对(3S,5S)-DAH具有严格的底物特异性,并且对其他β-氨基底物没有活性。然而,双突变体E310G/A314Y能将底物光谱扩展到(R)-β-homo Met,(R)-β-Phe,(S)-β-homo Tyr和(S)-β-AB。为了探究底物识别的分子机制,我们纯化并结晶了野生型AADH突变体E310G/A314Y,并确定它们的晶体结构(分别为野生型AADH的2.3?分辨率和2.48?分辨率)。通过比较这两种结构,我们发现Glu310与相邻链中的残基形成分子间氢键,因此阻止相应的loop移动。突变体E310G/A314Y中该loop的构象比野生型AADH中的构型灵活得多。我们进一步确定了在3.0?分辨率下突变体E310G/A314和NADP的复合物结构。我们发现Glu310在一条链中位于相邻链的活性位点。通过对上述复合物结构进行底物对接,我们发现NADP,底物和相邻链上的Glu 310之间的氢键网络稳定了底物的位置。底物3,5-二氨基己酸的大小恰好与活性口袋相匹配。残基Asp117和Met96使庞大的β-Phe远离NADP,从而防止其参与反应。突变体E310G/A314Y中由于关键性位点Glu310的突变,以及整体结构的灵活,底物3,5-二氨基己酸通过与Leu154、Asp49、Ser127之间的氢键,与蛋白之间进行结合,偏离了野生型中出现的活性口袋,距离的增加以及氢键网络的消失使活性下降。但是灵活的构象使β-Phe能够与Leu123、Asp177之间进行底物识别,但是随着与NADP之间的距离的增加,活性进一步降低。这解释了为什么突变体E310G/A314Y具有更为广阔的底物选择性。


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