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荧光假单胞菌P13的筛选及拮抗油菜菌核病菌的研究

李怀波  
【摘要】:在上海市郊采集常见作物的根际土壤样品,经分离和纯化后共得到254个产荧光的细菌菌株。采用平板对峙培养法测定这些菌株对油菜菌核病菌的拮抗效果,结果从这254个菌株中筛选出了一个高效菌株P13。实验表明,它对菌核病菌的生长具有较强的拮抗能力,同时还发现其对多种常见的植物病原真菌具有广谱拮抗作用。经电镜观察、培养物特征和一系列的生理生化实验鉴定,可初步确定P13菌株为产荧光假单胞杆菌属中的荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)。 为了提高P13菌株的抑菌效果,采用单因素与正交实验相结合的方法对培养基进行了优化,得到了P13菌株抑菌效果最好的培养基组成和培养条件。即最佳培养基组成(1000ml):蛋白胨20g,甘油5ml,K_2HPO_4 1.5g,MgSO_(4·)7H_2O2g;最佳培养条件:温度28℃,培养时间48h,pH8,装瓶量100ml/500ml,接种量5%。 由于P13菌株代谢产生的活性物质其性质、结构都属未知,分离纯化也没有一套固定的方法可以遵循。参照已知抗生物质的研究方法,采用有机溶剂萃取法,对抗菌物质进行了初步提取,结果发现乙酸乙酯和正丁醇的提取效果最好。同时为了保证整个提取纯化过程中生物活性不丧失,研究了温度、pH变化和紫外照射对P13发酵液中抗菌物质稳定性的影响。运用pH纸层析法研究了抗菌物质的离子特性,初步判断其可能是一类碱性抗生素,并且紫外测定发现最大吸收波长为265nm。 为了弄清油菜菌核病菌菌丝生长受抑制的原因,本实验运用光学、电子显微技术,研究了P13菌株发酵代谢产物对菌丝生长发育的影响,结果发现菌丝的生长发育受到了很大影响,表现为菌丝变形、菌丝壁溃解、原生质浓缩及外渗等异常现象,这是从抗菌作用的显微特征方面对抑菌机理所作的初步探讨。


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