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衣藻叶绿体中表达豆血红蛋白lba基因对其产氢影响的初步研究

阎光宇  
【摘要】: 模式生物莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)遗传学背景清晰、培养容易、生长速度快、实验操作容易,尤其是其氢化酶活性高、能利用太阳能和水生产氢气而被认为是非常有开发潜力的生物制氢的模式藻种。 目前利用衣藻产氢的最大障碍是氢化酶对氧气敏感,这导致衣藻产氢效率低,达不到工业化生产的要求。所以,从分子水平研究衣藻产氢代谢机理和利用基因工程手段提高衣藻产氢效率是当前的研究热点,最终目的是通过提高氢化酶的氧耐受性或者降低细胞内氧浓度以及提高电子传递效率来达到提高产氢效率的目的。 目前降低衣藻细胞内氧浓度的方法主要是使用缺硫培养基,因为培养基中缺硫导致衣藻叶绿体光合系统II(PSII)的D1蛋白修复受阻,抑制光解水产氧,使衣藻细胞处于缺氧状态而产氢,但抑制PSII光解水产氧的同时也抑制了光解水所释放的电子,而实验证明光合电子对产氢非常重要,所以抑制PSII活性最终也导致产氢率下降。 本实验尝试将能与氧可逆结合的大豆血红蛋白的基因lba转入衣藻的叶绿体中表达,希望通过lba蛋白的表达帮助降低叶绿体内氧气含量,增加产氢酶Hase活性;同时结合部分恢复PSⅡ活性以增加电子供应量,实现PSⅡ和氢化酶同时最大限度行使其功能,实现高效且持续产氢的设想。 本论文的主要内容及结果如下: ①提取大豆的总RNA,反转录成cDNA,从cDNA中克隆出了豆血红蛋白基因lba、lbc1、lbc2、Flbr。并成功构建了衣藻叶绿体转化表达载体cg401-1-lba。 ②利用基因枪法将载体cg401-1-lba转入到衣藻叶绿体中,通过壮观霉素筛选及继代培养,获得叶绿体转化突变株。 ③通过PCR及RT-PCR方法对转基因衣藻进行DNA及RNA水平的检测,确认质粒cg401-1-lba已成功转化到衣藻叶绿体中,并整合到叶绿体DNA上,获得正确转录。 ④通过Western Blotting方法对转基因衣藻进行蛋白水平的检测,确认lba基因在衣藻叶绿体中得到表达。 ⑤对转lba基因的衣藻生长情况进行检测表明:在对数生长后期时,转基因藻849-lba的OD750为2.7,比849低了20 %左右;细胞数比849低了1.0×106个/ml;叶绿素含量比848低了约11 %。说明lba基因的转入在一定程度上影响了衣藻的生长。 ⑥利用高效气相色谱分析仪检测转lba基因衣藻的产氢效率,结果表明在TAP培养基中转基因藻lba的氧气含量降到5 %,比849低了1-4倍,转基因藻的产氢量达到91μl,比849的产氢量高出50 %。在TAP-S培养基中转基因藻lba的氧气含量比849低了33-56 %,转基因藻的产氢量达到178μl,比849的产氢量高出29 %。 ⑦不同缺硫培养时,当培养基中的硫浓度为0时,转基因藻lba的氧气含量最低,产氢量和产氢速率最高;不同光照条件下,当光照强度为30μM·m-2·s-1时,转基因藻的氧气含量最低,产氢量最高。


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