收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

莱茵衣藻叶绿体中表达hemH和lba基因对其产氢影响的初步研究

黄瑞  
【摘要】: 在无氧条件下,莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中的氢化酶(H2ase)能将光合作用过程中产生的H+和e-或细胞内有机物分解产生的H+和e-合成H2,释放到细胞外。莱茵衣藻的氢化酶(H2ase)活性高,而且衣藻培养容易、遗传学背景清晰、生长速度快、实验操作容易,能利用太阳能和水制氢,被认为是目前非常有开发潜力的生物制氢的模式藻种。 虽然衣藻的氢化酶(H2ase)活性高,但是衣藻的氢化酶(H2ase)活性很容易受氧气的抑制而失去活性,而氧气又是光合作用的主要产物,这就导致了莱茵衣藻产氢效率低,限制了工业化产氢的发展。目前降低衣藻细胞内氧气含量的方法主要是通过去除培养基中硫元素来抑制光合系统II(PSII)活性、进而降低光解水产生的氧气,但是该方法同时抑制了光解水所产生的电子产量,限制了产氢的电子来源,所以最终导致产氢效率低。因此,要提高衣藻的产氢效率就需要既降低细胞内的氧浓度又要保障电子的供应。 大豆根瘤中的豆血红蛋白(leghemoglaobin,Lb),它与氧气有很高的亲和能力,能帮助降低细胞内氧浓度和调节呼吸作用,因而能使大豆根瘤中同样对氧气敏感的固氮酶具有高效固氮效率,生物发酵工程研究中已经有应用血红蛋白体外表达而使产量提高的报导。豆血红蛋白由两部分组成,一部分是球蛋白(globin),是由大豆(Glycine max)中的豆血红蛋白(Lbs)基因合成;另一部分是血红素,是由与大豆共生的慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)合成。在根瘤菌中,hemH基因编码合成的亚铁螯合酶(Ferrochelatase)它催化血红素合成的最后一步反应,而血红素的合成前体和代谢途径与高等植物和衣藻中叶绿素的合成相同,由5-aminolevulinic acid(ALA)经一系列反应合成而来,所以衣藻中含有充足的血红素合成的前体。 本实验尝试将慢生大豆根瘤菌中的亚铁螯合酶hemH基因和大豆中的豆血红球蛋白lba基因同时转入衣藻藻种cc849的叶绿体中,通过hemH基因表达亚铁螯合酶(Ferrochelatase)催化合成血红素,与球蛋白lba一起帮助降低叶绿体内氧气含量,增加产氢酶H2ase活性;同时结合部分恢复PSⅡ活性以增加电子供应量,实现PSⅡ和氢酶同时最大限度行使其功能,为实现在常规条件下利用太阳能持续生产氢能的研究奠定实验基础。 本论文的主要内容及结果如下: 1.提取慢生大豆根瘤菌的总DNA,从总DNA中克隆出了表达亚铁螯合酶的基因hemH,与本实验室前期克隆的球蛋白基因lba一起成功地构建了衣藻叶绿体转化表达载体cg401-1-hemH-lba。 2.通过基因枪法将载体cg401-1-hemH-lba转入到莱茵衣藻叶绿体中,通过壮观霉素筛选及液固反复继代培养,获得转基因藻株。 3.通过PCR及RT-PCR扩增检测的方法对转基因衣藻hemH-lba进行DNA及RNA水平的检测,PCR结果证实hemH和lba编码区DNA已整合到部分衣藻叶绿体基因组中,RT-PCR的结果表明hemH和lba基因在RNA水平上得到转录。 4.通过Western Blot方法对转基因衣藻hemH-lba进行蛋白水平的检测,正常培养条件下hemH基因和lba基因的蛋白在衣藻叶绿体中都得到了表达,第六天(饱和期)表达量最大,在产氢培养第五天时蛋白量达到最大。 5.对野生藻849和转基因衣藻hemH-lba的生长情况进行检测表明:野生藻849饱和时的最大OD750值是3.5;转基因衣藻hemH-lba饱和时的最大OD750值是3,略低于野生藻849。饱和期时转基因衣藻hemH-lba的最大叶绿素含量为40mg/L左右,而野生藻849的最大叶绿素含量约为36mg/L左右,比转基因衣藻hemH-lba略低。结果表明,基因hemH-lba的转入影响了莱茵衣藻的生长速度,但是叶绿素含量没有受到影响。 6.利用紫外分光光度计扫描野生藻和转基因衣藻hemH-lba在500nm到600nm的OD值,在550nm处转基因衣藻hemH-lba有血红素吸收峰,表明有微量血红素合成。 7.比较了野生藻849和转基因衣藻hemH-lba在不同含硫浓度0、12.5、25、50μM下的氢气产量,氧气含量和产氢速率。结果表明,在各个含硫浓度下转基因衣藻hemH-lba的氧气量都是比野生藻849的氧气量下降的快,产氢量比野生藻849有所提高。 8.通过对转基因衣藻hemH-lba及其野生藻849进行光照强度、叶绿素含量、含硫量三因素三水平的正交实验,确定了以TAP为培养基的转基因衣藻hemH-lba及野生藻849的最佳产氢条件。实验结果表明,在培养条件25℃下,转基因衣藻hemH-lba的最佳产氢条件为光照强度60μmol m~(-2) s~(-1),叶绿素含量0.5mg,含硫量12.5μmol/L;而野生藻849的最佳产氢条件为光照强度60μmol m~(-2) s~(-1),叶绿素含量0.5mg,含硫量0mol/L。 9.根据密码子的简并性修改了亚铁螯合酶基因(hemH)的碱基,使得hemH碱基对中的AT含量达到了63%,利用已修改碱基的大豆球蛋白基因lba-M成功地构建了另一个衣藻叶绿体转化表达载体cg401-1-hemH-lba-M,现已获得转基因藻株。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 李亚军;费小雯;邓晓东;;2种微藻总RNA提取方法的比较[J];热带农业科学;2011年05期
2 黄爱优;王广策;何林文;牛建峰;张宝玉;;浒苔小RNA高通量测序及相关生物信息学分析[J];科学通报;2011年24期
3 张静;王绪敏;刘涛;宫庆礼;;藻类线粒体DNA研究进展[J];高技术通讯;2010年02期
4 陈起振;张志仙;曹家树;;利用人工microRNA实现基因沉默[J];中国细胞生物学学报;2011年04期
5 阎赟梦;李庆华;李杰;柴丹丹;薛乐勋;;杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析[J];郑州大学学报(医学版);2011年04期
6 于惠敏;石竹;邵洪伟;;植物细胞核与叶绿体基因的双向调控作用[J];生物学通报;2011年06期
7 尚常花;朱顺妮;袁振宏;王忠铭;;巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析(英文)[J];Agricultural Science & Technology;2011年07期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
11 ;[J];;年期
12 ;[J];;年期
13 ;[J];;年期
14 ;[J];;年期
15 ;[J];;年期
16 ;[J];;年期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 米丽拜尔;吾甫尔·米吉提;西尔艾力·奥布力;阿布都克力木·白克尔;;莱茵衣藻(Ch/amydomonas reinhardtii)中叶绿素b生物合成途径的研究进展[A];中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2011年
2 胡章立;吴锦霞;黎双飞;王潮岗;;转KK基因莱茵衣藻的构建及其生物学活性研究[A];中国海洋湖沼学会藻类学分会第七届会员大会暨第十四次学术讨论会论文摘要集[C];2007年
3 吴志华;黎双飞;胡章立;;外源基因(aadA)在莱茵衣藻线粒体中表达的研究[A];中国海洋湖沼学会藻类学分会第七届会员大会暨第十四次学术讨论会论文摘要集[C];2007年
4 胡章立;范准;吴志华;陈俊;;外源Ble基因在莱茵衣藻线粒体中的有效表达[A];中国藻类学会第八次会员代表大会暨第十六次学术讨论会论文摘要集[C];2011年
5 陈俊;吴锦霞;胡章立;;klk1基因在莱茵衣藻中的有效表达及其调控研究[A];中国藻类学会第八次会员代表大会暨第十六次学术讨论会论文摘要集[C];2011年
6 胡章立;舒龙飞;李辉;;莱茵衣藻缺硫放氢过程microRNAs组学及其功能研究[A];中国藻类学会第八次会员代表大会暨第十六次学术讨论会论文摘要集[C];2011年
7 田琪琳;施定基;贾晓会;王晓燕;黄希文;何培民;;莱茵衣藻PEPC2基因的克隆[A];中国藻类学会第八次会员代表大会暨第十六次学术讨论会论文摘要集[C];2011年
8 古力孜拉;史博;热依汗古丽;吾甫尔·米吉提;;莱茵衣藻(Chlammydomonas reinhardtii)野生型和不同突变株对NaCl抗性检测分析[A];中国第六届海峡两岸菌物学学术研讨会论文集[C];2004年
9 吴志华;黎双飞;胡章立;;莱茵衣藻线粒体外源基因表达系统的初步研究[A];广东省植物学会第十七期学术研讨会论文集[C];2008年
10 张文平;吾甫尔·米吉提;;莱茵衣藻遗传转化的研究技术及方法[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 苏忠亮;一种抗肿瘤蛋白基因在衣藻叶绿体中的重组与表达[D];浙江大学;2005年
2 檀琮萍;两种真核微藻类胡萝卜素代谢工程的初步研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2006年
3 孙煜;建立盐藻遗传转化系统的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2003年
4 迟晓元;微藻脂肪酸去饱和酶基因的比较基因组学分析及重要基因功能的验证[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2008年
5 刘志媛;铁对几种不同代谢类型微藻的生长和油脂积累的影响[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2008年
6 李惠英;小球藻南极株抗寒机理的研究[D];中国科学院研究生院(水生生物研究所);2007年
7 贺立静;微藻产氢研究及2种绿藻氢酶基因的克隆[D];暨南大学;2007年
8 冉春秋;海水绿藻和淡水绿藻光照产氢特征的比较研究[D];中国科学院研究生院(大连化学物理研究所);2006年
9 刘秀娟;典型有机污染物绿色环保分析技术与降解研究[D];华中师范大学;2011年
10 姚建亭;海带蓝光受体及相关基因的研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 黄瑞;莱茵衣藻叶绿体中表达hemH和lba基因对其产氢影响的初步研究[D];上海师范大学;2010年
2 曹军平;莱茵衣藻外源基因高效转化系统的建立及金藻转化方法的研究[D];中国农业科学院;2000年
3 许丽丽;密码子优化对豆血红蛋白基因在莱茵衣藻叶绿体中表达和产氢的影响[D];上海师范大学;2011年
4 徐田枚;莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)Nfr-4突变株的突变性质分析[D];新疆大学;2007年
5 艾山江·阿不都拉;莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii.)cbn1和cao突变基因的对比分析及CAO基因的分子定位[D];新疆大学;2007年
6 王荣荣;一个衣藻突变株产氢特性的初步研究[D];上海师范大学;2010年
7 江用彬;莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)对镉污染水体的生物修复研究[D];首都师范大学;2007年
8 张文平;莱茵衣藻遗传转化条件的优化及表皮生长因子基因的转化[D];新疆大学;2005年
9 刘国宪;狂犬病G,N抗原基因在衣藻叶绿体中的定点重组和表达[D];首都师范大学;2009年
10 王连军;NaHSO_3提高了莱茵衣藻的光合产氢[D];上海师范大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 ;大唐科技中标内蒙古区电信本地计费账务系统[N];人民邮电;2001年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978