脂肪酶产生菌F.Oxysporum_SHM的分离鉴定及其发酵条件优化

【摘要】：脂肪酶是一种可以水解脂肪的酶类,催化脂肪水解为甘油和脂肪酸。动物、植物和微生物都可以分泌脂肪酶,其中微生物脂肪酶广泛应用于脂肪的生产工业、去污工业和食品工业等领域。国内外对脂肪酶研究涉及脂肪酶结构催化特性、高产菌株选育和发酵条件控制等方面。本研究通过筛选鉴定得到一株具有自主知识产权的脂肪酶生产菌株F.Oxysporum_SHM,并对其发酵条件和脂肪酶粗酶的酶学性质进行初步探讨。首先采用橄榄油为唯一碳源的培养基从油脂实验室空气、居民家灶台和食堂附近土壤中筛选可以利用油脂的微生物,经过初筛和复筛获得一株酶活力相对较高菌株Y18,通过形态学和分子生物学鉴定确定其属于丛梗孢科(Monilianceae)镰孢菌属(Fusarium LK)尖孢镰刀菌(Fusarium Oxysporum),初步命名为F.Oxysporum_SHM。然后对该菌株发酵条件进行优化。在选出适宜的基础培养基后,对油脂、碳源、氮源、KH2PO4、Mg SO4、p H和装液量等单因素进行优化,并利用响应面设计(CCD)确定了发酵最优条件,即:1%亚麻籽油、0.5 g/L Mg SO4?7H2O、2.0 g/L K2HPO4?3H2O、8.0 g/L蔗糖、30.0 g/L胰蛋白胨、p H8.0、装液量30.0 m L/250 m L。在此条件下,预测发酵产脂肪酶活力为5566.85 U/m L,实际测得发酵产酶活力为5216.23 U/m L,与模型预测接近。最后对F.Oxysporum_SHM脂肪酶粗酶的酶学性质进行初步探讨。通过硫酸铵盐析、透析除盐、Mono Q阴离子交换层析得到较纯的F.Oxysporum_SHM脂肪酶,与发酵液相比纯化了27.10倍。对透析除盐后冷冻干燥的脂肪酶粗酶进行酶学性质分析,该酶最适温度为40℃,并在45℃以下较稳定;该酶最适p H 9.0,在p H3.0~10.0范围内较稳定;Ca2+、Fe2+、Mn2+可以不同程度地提高脂肪酶活力,其中Fe2+作用显著,酶活力提高181%,Mg2+、Cu2+对酶活力有抑制作用,分别保留了83.82%和76.98%的残余酶活力;利用双导数法测定该脂肪酶水解p-NPP的Km为270.36 mg/L、Vmax为25.91 nmol/min·mg;通过与两种商品脂肪酶活力比较表明,F.Oxysporum_SHM脂肪酶活力较高,两种商品仅为其活力的6.2%和13.6%。