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酪蛋白纳米球的制备及其细胞摄取研究

刘成杰  
【摘要】:纳米载体是近年来研究的热点,它能增加负载药物的溶解度、改善药物的吸收和生物利用度、提高药物的靶向输送等,因此纳米控释系统作为独特的药物新剂型得到越来越广泛的关注。生物降解高分子材料因可在生物体内分解,参与生物体的新陈代谢,并最终排出体外,而成为制备药物载体的首选材料。但目前具有生物相容性好、可生物降解性质的纳米载体材料来源有限。天然高分子由于其源于自然界,资源丰富、容易获取,具有很好的生物相容性、可降解性和较低的毒性,在作为药物载体材料方面具有较为明显的优势。 蛋白药物、DNA、RNA和其它生物活性分子往往需要进入到细胞内或细胞核内发挥作用,但它们本身并不能进入到细胞内。现有的通过细胞膜向细胞内转运的技术有电穿孔、显微注射、脂质体转染和病毒载体等。电穿孔和显微注射对细胞具有较强的损伤作用;并且几乎所有药物载体都是以内吞形式进入细胞,之后局限于内涵体内,以至于最终被溶酶体消化降解,从而影响效应分子的药效。因此必须建立和开发高效、安全、实用的药物运输载体,将药物高效导入细胞内,从而让药物充分发挥作用。本论文利用牛奶中的天然蛋白—酪蛋白—为原料合成酪蛋白纳米球以及酪蛋白空心球,并用于抗肿瘤药物的释放。同时,研究发现该酪蛋白纳米球进入细胞的能力不受细胞类型、温度、能量的影响,并且进入细胞后主要分布在细胞质中。本论文主要包括下面四个方面的工作: (1)以酪蛋白和丙烯酸这一大分子—单体对为体系,通过聚合丙烯酸单体合成了酪蛋白-聚丙烯酸复合纳米球,通过交联酪蛋白改善了复合微球的pH稳定性。复合纳米球的粒径可以通过改变制备条件如浓度、丙烯酸与酪蛋白的摩尔比、温度、引发剂与丙烯酸的摩尔比、反应时间来调控。酪蛋白纳米球具有较好的生物相容性并可装载顺铂使其持续释放。同时,酪蛋白载药纳米微粒的细胞毒性比同浓度的顺铂裸药要大。 (2)通过在酪蛋白和丙烯酸体系中添加丙酸合成了酪蛋白纳米空心球。研究发现添加丙酸不仅可以提高酪蛋白在水中的溶解性,同时能调节酪蛋白和聚丙烯酸之间的静电作用。通过改变聚合条件可调控复合纳米粒子的粒径并可实现复合纳米球从实心球向空心球的转变,同时透析掉复合纳米空心球中的聚丙烯酸组分可获得纯酪蛋白纳米空心球。实验表明酪蛋白纳米空心球同样具有较好的生物相容性并能装载顺铂使其持续释放,同时,酪蛋白载药纳米微粒的细胞毒性比同浓度的顺铂裸药要大。 (3)开展了酪蛋白纳米空心球的细胞摄取研究。研究发现酪蛋白、αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白及其纳米粒子在37℃或4℃均能进入细胞;激光共聚焦显微镜和流式细胞仪研究发现低温及各种胞吞阻断试剂都不能有效地阻止酪蛋白纳米粒子进入细胞;并且发现酪蛋白纳米粒子进入细胞的能力不受细胞类型、温度、能量的影响;激光共聚焦显微镜和透射电镜观察发现酪蛋白纳米粒子进入细胞后主要分布在细胞质中;同时,利用激光共聚焦显微镜实时观察了酪蛋白纳米空心球进入宫颈癌细胞(HeLa)的过程。最终我们提出了酪蛋白纳米粒子进入细胞的主要机制可能是:酪蛋白纳米粒子首先吸附在细胞膜上,随后与细胞膜融合并最终穿越细胞双层膜。 (4)利用不同的交联剂即硫酸钙、京尼平、转谷氨酰胺酶来交联酪蛋白聚丙烯酸纳米空心球,详细考察了交联条件对纳米粒子稳定性的影响,并得到了各种交联剂交联酪蛋白-聚丙烯酸纳米空心球的最佳条件。与戊二醛交联的酪蛋白纳米空心球相比,Ca2+或转谷氨酰胺酶交联后最终得到的酪蛋白纳空心球具有更好的生物相容性。另外,利用酪蛋白的还原性,原位还原制备了负载金的酪蛋白-聚丙烯酸复合纳米球,而且发现纳米金的尺寸可以通过改变温度、反应时间、HAuCl4与体系中酪蛋白的质量比来调控。


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