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采用酵母表达载体pWX530重组构建表达rhCEMP1

欧伟  
【摘要】:牙骨质蛋白1(CEMP1)是一种新近从成牙骨质细胞瘤中克隆出的牙骨质蛋白亚型。有研究发现,CEMP1的表达仅限于成牙骨质细胞群体中,且可能在牙周膜细胞分化中起着重要作用,因此它成为牙骨质特有的生物标记。学者们发现CEMP1能促进体外培养的细胞黏附、分化:在生物矿化过程中有促进磷酸八钙(OCP)晶体成核的作用;在非骨形成细胞中CEMP1的表达具有诱导矿化结节结构形成、促进钙沉积的能力。这些结果提示CEMP1在牙骨质形成中可能存在诱导作用,可为实现生理性种植牙提供帮助。本研究拟通过生物工程技术,构建含CEMP1的真核表达载体,转入酵母细胞中表达,通过分离提纯得到CEMP1。 第一部分rhCEMP1真核表达载体的构建 目的:构建含rhCEMP1基因的真核表达载体。 方法:采用PCR方法扩增rhCEMP1基因,利用定向克隆技术将rhCEMP1基因插入到中间载体pTeasy中,再进一步转插入载体pWX530。重组的pWX530-rhCEMP1在大肠杆菌DH5α中扩增后,通过酶切电泳鉴定和DNA序列测定所构建的质粒。 结果:酶切电泳鉴定和DNA序列测定证实重组质粒插入基因序列为rhCEMP1DNA。 结论:成功构建含rhCEMP1基因的真核表达载体pWX530-rhCEMP1。 第二部分rhCEMP1在酵母中的表达、分离和提纯 目的:观察rhCEMP1在酵母中表达情况并分离提纯。 方法:表达载体pWX530-rhCEMPl转入酵母感受态细胞中,酵母经氨基酸营养缺陷型筛选后培养表达。利用SDS-PAGE电泳和ELISA分析蛋白表达情况,离子交换层析提纯蛋白。 结果:重组质粒成功转入酵母细胞,通过SDS-PAGE和ELISA检测rhCEMP1表达成功。 结论:构建的表达载体pWX530-rhCEMPl能转入酵母细胞并成功表达。


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