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环境中磺胺类抗生素及其抗性基因的污染特征及风险研究

王娜  
【摘要】:近年来,“速生鸡”“有抗奶”等事件的不断曝光,不仅触动了公众在食品安全领域的敏感神经,同时抗生素抗性基因等新型环境污染物也逐步引起了广泛关注。磺胺类抗生素是畜牧业和水产养殖业中广泛使用的抗菌药物,具有高水溶性、低螯合能力和低结合常数等特点,施用于动物后大部分会以原药或代谢物的形式经动物粪便和尿液排出并最终进入环境。它们在环境中的残留和长期存在,将胁迫微生物产生耐药性,并可能通过基因水平转移方式传递到其他菌群,进一步通过食物链传递到人体,威胁人类生命安全。长期以来,由于对抗生素的环境危害认识不足,我国对兽药抗生素一直缺乏有效的环境管理。本文以磺胺类抗生素作为代表品种,揭示磺胺类抗生素的环境污染特征,明确粪源引入磺胺类抗生素的环境归趋,探明环境中磺胺类抗生素耐药菌及抗性基因分布特征以及与抗生素暴露浓度的相关性,为我国建立兽药抗生素环境安全性评价体系提供基础数据与技术支撑。 本文选择磺胺嘧啶,磺胺甲嘧啶,磺胺二甲嘧啶,磺胺二甲氧嘧啶和磺胺甲嗯唑五种磺胺类抗生素作为研究对象,通过文献查阅、养殖场调研、采样分析、室内实验、统计分析等多种方法,研究了养猪场、奶牛场、养鸡场三类典型的污染场景下磺胺类抗生素的暴露水平与纵向归趋规律,并与四环素等其他常用抗生素进行了比较;考察了粪肥的添加、土壤pH值、有机碳含量等因素对磺胺类抗生素在五种不同土壤(东北黑土,江西红壤,太湖水稻土、陕西潮土、南京黄棕壤)中的降解、吸附和淋溶影响;研究了施用粪肥对土壤中微生物种群和抗性基因的影响,揭示了磺胺类耐药菌中的抗性基因分布规律;最后建立了定性表征兽药环境健康风险的程序和方法,同时筛选得到我国兽药环境优先管理清单。主要研究结果如下: (1)研究发现,养殖场普遍使用抗生素作为饲料添加剂以及治疗药物,导致动物粪便、养殖场农田土壤、蔬菜、水体、底泥、鱼体等暴露介质广泛检出抗生素原型药物。其中,鸡场的抗生素污染最为严重,其次为猪场。通过典型抗生素在养殖场暴露的归趋分析,发现这些药物在养殖场的污染特征与其物理化学及环境行为特性等密切相关。同时,对抗生素从粪便到土壤以及从土壤到植物的迁移进行了模型预测与验证,为揭示抗生素的迁移规律和预测抗生素的暴露水平提供了基础。通过对不同药物作为饲料添加剂的贡献比进行计算,表明正常剂量使用抗生素添加剂不是养殖场抗生素污染的最主要来源。 (2)研究表明,五种磺胺类抗生素在不同类型土壤中的降解规律均能较好地用双指数函数方程描述。五种磺胺类抗生素在不同土壤中的降解趋势为:松沙土≈壤土粘壤土;在江西红壤中,五种磺胺类抗生素的降解速率顺序为:磺胺甲嘧啶磺胺嘧啶磺胺二甲氧嘧啶磺胺二甲嘧啶磺胺甲嗯唑。避光条件下,粪便的加入使得降解速率明显加快,尤其是江西红壤-粪便混合基质中的降解速率变化最为显著。磺胺类抗生素光照条件较避光条件下降解半衰期差异不大。五种磺胺类抗生素在江西红壤、太湖水稻土、东北黑土、陕西潮土与南京黄棕壤中的吸附较好地符合Freundlich方程,五种磺胺类抗生素在供试土壤中吸附性大致排列顺序依次为:东北黑土≈无锡水稻土江西红壤南京黄棕壤≈陕西潮土。影响磺胺类抗生素土壤吸附性的重要因素是土壤有机质含量和土壤pH。研究发现,药物的极性越大,其在加入粪便的土壤基质中Kd值增高越多。根据疏水pH分区模型,pH在4-6.5范围内时对吸附影响不大。五种磺胺类抗生素在五种土壤中的淋溶速率为:陕西潮土南京黄棕壤江西红壤无锡水稻土东北黑土。五种磺胺类抗生素在土壤中的移动规律和土壤吸附性有明显的负相关关系。粪便对土壤淋溶性能有一定影响,能吸附磺胺类抗生素,减少其移动。通过GUS模型估算磺胺类抗生素在土壤中的淋溶能力,验证了粪便对降低磺胺类抗生素在土壤中的淋溶能力有一定的作用。 (3)研究显示,土壤中耐药菌的数量与施肥与否密切相关。在所有分析的土壤样本中,芽孢杆菌属(Bacillus)检出率最高,占到43.88%,其次为假单胞菌菌属(Pseudomonas)和志贺氏菌属(Shigella),分别占11.39%和8.02%。以16srDNA基因为内参,利用荧光实时定量PCR技术进一步分析了各种土壤样品中3种磺胺抗性基因(sul1、sul2和sul3)的相对含量,结果发现:在施用过猪粪肥的土壤中,sull的相对含量明显高于sul2,而在施用过鸡粪肥的土壤中,sul2的相对含量明显高于sul1。sul1和sul2的相对含量远远高于sul3。另外,sul2基因的丰度以及总sul基因丰度与土壤中可培养细菌总数存在显著的正相关性,相关系数(R2)分别为0.95和0.65(p0.05)。利用sul1、sul2、sul3特异引物对分离到的耐药菌染色体和质粒DNA上的磺胺抗性基因进行了分析,发现粪便样本中三种sul基因在的耐药菌染色体和质粒DNA检出率为100%;森林土壤样本仅基因组DNA上有sul2基因,可能sull和sul3是与养殖动物相关的基因;未施肥土壤样本中基因组DNA上有sul2基因,质粒DNA上存在sul1,sul2和sul3基因,说明质粒可能是抗性基因水平转移的载体。施肥土壤样本中,总体检出顺序为sul2 sull sul3(p0.05);养鸡场土壤耐药菌sul检出率大于养猪场;基因联合存在形式sul1+sul2, sul1+sul2+sul3检出率高,sul2+sul3极少见,sul1+sul3未见,联合基因的检出率与粪便施肥的频率和数量有关。利用RT-PCR方法考察了土壤中优势耐药菌菌株炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis SYN201, G+)和弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri NJJN802, G-)在含有不同浓度磺胺类药物的培养基中生长不同时间后抗性基因sul1、sul2和sul3的表达变化,结果发现:无论培养基中是否存在磺胺类药物,菌株SYN201和NJJN802中的3种磺胺类抗性基因均分别在培养72h或36h时出现一个表达峰,而在其他培养时间下不表达或表达量处于一个相对极低的水平;磺胺嘧啶的存在有助于提高此特征表达时间下抗性基因的表达水平,并呈现出明显的剂量-效应关系。 (4)根据兽药进入环境的可能性和生态与健康毒性效应,对中国药典中收录的一般兽药活性成分进行了环境管理优先级排序。77种排序药物中有38种药物被分级为高风险,尽管有部分数据的缺失。通过分级结果,发现抗生素药物是最需要管理和关注的药物品种,占57.9%。另外,在水产养殖中广泛使用的杀虫剂消毒剂也是优先级别很高的一类药物。该风险分级的结果可以给环境管理部门的管理决策提供方向性指导,同时为进一步开展具体兽药风险评估工作筛选出重点的品种。


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