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上皮细胞凋亡过程中细胞自我分子标志CD47在细胞表面分布状态变化机制的研究

吕志远  
【摘要】:细胞凋亡是多细胞生物维持机体正常平稳运行的重要机制,及时有效的清除凋亡细胞则是这一机制的重要组成部分。一方面,凋亡细胞在自身表面展示了一些特定的分子作为"eat me"信号,这些分子可通过与它们各自在吞噬细胞表面的受体相作用以引导吞噬过程;另一方面,凋亡细胞在正常状态时所展示的具有抑制吞噬功能的‘'don't eat me"信号将在细胞凋亡过程中失去作用。 CD47是SIRP α的配体,通过它们的相互作用可以介导诸多细胞功能,这其中就包括了CD47与吞噬细胞表面SIRP α作用时所产生的吞噬抑制作用。因此CD47也被看做是非常关键的"don't eat me"信号分子。但CD47在细胞凋亡过程中却失去了吞噬抑制功能,人们对这一变化的分子机制尚不清楚。本课题主要着眼于上皮细胞凋亡过程中CD47是如何失去"don't eat me"信号功能的。 通过免疫荧光和流式细胞技术,我们发现在上皮细胞系HT-29、T-47D及MCF-7进入凋亡过程后,细胞表面的CD47表达量并没有明显改变,但凋亡细胞却不能像正常细胞一样粘附于SIRP α-Ex包埋的96孔板。进一步的生化分析发现,CD47在健康上皮细胞表面成斑点状分布,但当细胞进入凋亡状态时,CD47在细胞表面逐渐呈现弥散状分布。 我们通过一系列的实验判断细胞表面大多数CD47并非定位于脂筏结构或蛋白多聚体,而更可能是通过自身糖链与其它蛋白分子(如凝集素)相互作用形成CD47-凝集素窗格样结构,因此当健康细胞表面这种聚集状态的CD47与吞噬细胞表面SIRP α相作用时,可产生足够强的"don't eat me"信号以抑制吞噬作用,但当细胞凋亡发生后,CD47糖链发生改变,这种窗格样微结构被解散,因此当凋亡细胞CD47与SIRP α作用时将不足以产生能有效抑制吞噬的信号。 当我们以PNGase F或NaIO4尝试破坏细胞表面N-连接糖链构造后,细胞表面CD47的分布状态呈弥散化,并且明显减弱了对SIRP α-Ex包埋的96孔板的粘附功能。此外,我们已经构建了一系列去除特定糖基化位点的CD47突变体,并转染了CaCO2细胞,经荧光染色实验,发现其中转染某些突变体的CaCO2细胞表面CD47的分布状态也同凋亡细胞一样呈现弥散化。在此基础上,我们将进一步对这些转染去糖基化CD47突变体的CaCO2细胞进行功能方面的研究。


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