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基于生物核磁共振与液质联用的代谢组学及药代动力学研究

何翠翠  
【摘要】:一.代谢组学在药物毒性及疾病诊断方面的应用基于核磁共振、液质联用等技术的代谢组学是将生物体作为统一整体,研究其对外应激后的内源性小分子代谢物变化,并结合信息学技术,分析生物体在不同状态下代谢指纹的差异,获得生物标记物,解释生物体在特定时间和环境下的整体功能状态。本文利用基于核磁共振的代谢组学技术分别在药物毒性和疾病诊断方面进行研究。a)基于核磁共振的代谢组学对药物毒性的评价利用基于核磁共振的代谢组学技术结合模式识别主成分分析(PCA)的方法,对临床上具有药物毒性争议的升麻化合物进行了研究。我们选择升麻三萜中的有效成分之一升麻酮醇苷H-2为研究对象,将其对SD大鼠连续灌胃给药一周,给药剂量为50 mg/kg/day,我们通过大鼠尿液、肝脏萃取物和血浆的核磁共振谱图比较,发现给药组尿液中的牛磺酸、氧化三甲胺、甜菜碱和乙酸盐含量升高;血浆中的肌酸/肌酐、葡萄糖、丙氨酸、氧化三甲胺和甜菜碱含量升高,乳酸盐含量降低;肝脏水溶性萃取物中琥珀酸、肝糖原、甘油磷酸胆碱/胆碱、氧化三甲胺和甜菜碱含量升高,缬氨酸、葡萄糖和乳酸盐含量降低,而在肝脏的脂溶性萃取物中没有发现任何变化。这些小分子的变化暗示着升麻酮醇苷H-2干扰了肝肾中能量和氨基酸代谢,有一定的肝肾毒性,根据PCA因子得分图显示,给药组偏离空白组不远,说明其肝肾毒性很弱,不能导致机体组织病理学的变化以及生化水平的异差。本实验对临床上使用升麻后出现的肝肾毒性提供了合理的解释。b)基于核磁共振的代谢组学对疾病诊断的应用利用基于核磁共振的代谢组学技术结合多变量统计判别方程式分析(DFA)方法,比较了恶性和良性胸腔积液的核磁共振谱图,共筛选出12个小分子(9个为胸腔积液中新发现的小分子),其中恶性胸腔积液中的缬氨酸,乳酸盐和丙氨酸盐水平明显高于良性胸腔积液,但其乙酰乙酸盐、氧化三甲胺/甜菜碱,α-和β-葡萄糖水平明显低于良性胸腔积液,差异有统计学意义(P0.05)。采用判别方程分析法对良性和恶性胸腔积液中小分子标记物进一步统计分析,经过逐步判别法,得出乳酸盐、乙酰乙酸盐、氧化三甲胺/甜菜碱和α-葡萄糖小分子标记物联合检测具有最大的鉴别度(P0.001),建立的判别方程具有高的灵敏度、特异性和准确度,在训练组中和验证组的准确度分别为95.8%和97.0%。利用此判别方程可以灵敏、准确、高效的鉴定出良性和恶性胸腔积液,具有重要的临床意义。二.抗骨质疏松药物的药物代谢动力学研究药物代谢动力学是药理学重要的组成部分,在创新药物研制过程中,药物代谢动力学研究已成为药物临床前研究和临床研究的重要组成部分。液相-质谱联用技术(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS)是现代分析技术中常用的分析手段,其结合了液相的分离能力和质谱的鉴别能力,成为当代分析中最重要的分析手段之一。我们分别利用液质联用技术建立了两种抗骨质疏松药物的血浆中的分析方法,并对其进行了药代动力学研究。a)升麻酮醇苷H-2在小鼠体内药物代谢动力学的研究建立了高效液相色谱-串联质谱法测定小鼠血浆中升麻酮醇苷H-2浓度的方法,采用液液萃取的样品处理方法,选择Cimicidanol作为内标,使用C18柱分离,质谱以MRM方式检测。结果显示升麻酮醇苷H-2在5-20000 ng/ml范围内线性关系良好,最低定量限为5ng/ml,日内、日间RSD%符合方法学要求。给药剂量为25 mg/ml,小鼠口服给药的药动学模型为二室模型,静脉注射给药的药动学模型为三室模型,口服生物利用度为24.8%。b) QOA-8a的体外、体内药物代谢动力学研究建立了测定大鼠和人肝微粒体体外温孵体系中QOA-8a的HPLC方法,结果显示QOA-8a在1-100 gM范围内线性关系良好,日内、日间RSD%符合方法学要求。并研究了其体外酶促反应动力学,得到酶促动力学参数,结果显示QOA-8a在肝微粒体中代谢均较快,说明该药可能肝首过效应较强。同时检测出一种代谢产物,经鉴定其为QOA-8a酯基水解产物。建立了高效液相色谱-串联质谱法测定大鼠血浆中QOA-8a及其代谢产物GA的方法,采用液液萃取的样品前处理方法,使用C18柱分离,质谱以MRM方式检测。结果显示QOA-8a在1-1000 ng/ml,GA在5-1000 ng/ml范围内线性关系良好,日间、日内精密度符合方法学要求。给药剂量为1 mmg/m1,大鼠口服灌胃给药和静脉注射给药的药动学模型为均为二室模型,口服生物利用度为32.6%。


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