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微小RNA-132在卵巢颗粒细胞中的功能研究

吴少亘  
【摘要】:第一章微小RNA-132通过抑制Nurrl促进卵巢颗粒细胞雌激素的合成目的:研究卵巢颗粒细胞中卵泡刺激素(FSH)通路对微小RNA-132 (miR-132)的调控以及miR-132影响颗粒细胞雌激素合成的分子机制。方法:体外分离培养21天ICR小鼠的原代卵巢颗粒细胞(mGC),经8-Br-cAMP处理24 h后检测mGC中miR-132的表达变化。mGC分别转染miR-132模拟物(mimics)、Nurrl小干扰RNA、Flag-Nurrl质粒或对应阴性对照48 h后,免疫化学发光法检测细胞培养上清雌二醇(E2)和孕酮的浓度,real time PCR检测Cyp19a1、Cyp11a1和Nurrl的mRNA水平改变;Western blot检测miR-132对Nurrl蛋白表达的影响。构建含有Nurrl基因3’不翻译端(3'-UTR)序列的荧光素酶报告基因质粒,验证miR-132对Nurrl基因表达的转录后抑制作用。结果:体外培养的mGC经8-Br-cAMP处理24 h后,miR-132的表达持续升高,并于12h达到峰值(4.8倍,P0.05)。高表达miR-132的mGC E2分泌水平升高70%以上(P0.01),而孕酮分泌无明显改变。Real time PCR结果显示miR-132促进雌激素合成限速酶-芳香化酶基因Cypl9al的表达(2.8倍,P0.01),而孕激素合成关键酶基因Cypllal无明显改变。mGC高表达miR-132后Nurr1蛋白水平明显抑制,但Nurrl mRNA的水平无显著改变;miR-132可显著抑制pmirGLO-luc-Nurrl 3'-UTR-WT质粒荧光素酶活性(P0.01),而对其靶向序列突变后的pmirGLO-luc-Nurrl 3'-UTR-MU质粒无显著影响。以上研究表明miR-132可通过转录后抑制孤儿核受体Nurr1的表达,减弱Nurr1对Cypl9al基因PII启动子的抑制。mGC转染siNurr1干扰内源性Nurr1表达后,miR-132促进E2合成的作用被明显削弱;mGC中高表达Flag-Nurr1后,外源性Nurr1可显著抵消miR-132促进E2合成的效应。结论:miR-132通过靶向Nurr1 mRNA的3'-UTR,转录后抑制Nurr1的蛋白表达,间接上调Cyp19a1,促进卵巢颗粒细胞的E2合成。第二章微小RNA-132靶向抑制Foxal诱导卵巢颗粒细胞凋亡目的: 研究miR-132通过直接靶向抑制小鼠卵巢中Foxal基因的蛋白表达,进而影响雌激素受体(ER)通路,促进颗粒细胞凋亡的分子机制。方法:在原代培养的mGC瞬时转染miR-132 mimics高表达外源性miR-132后,分别通过流式细胞术Annexin V和Cell Death Detection ELISA检测颗粒细胞凋亡程度。Western blot检测miR-132高表达对mGC中ERa和ERβ蛋白表达的影响。免疫组织化学检测Foxal在小鼠卵巢卵泡中的表达和分布,以及检测PMSG处理后卵巢Foxal表达的变化。荧光素酶报告基因实验和Western blot验证Foxal为miR-132直接的靶基因。利用Foxal特异性的小干扰RNA (siRNA)序列基因沉默内源性Foxal,研究其通过下调ERa参与mGC凋亡的机制。此外通过细胞免疫荧光实验观察miR-132对ERa蛋白核定位的影响。结果:流式细胞术Annexin V和Cell Death Detection ELISA检测结果均显示转染miR-132 mimics后促进mGC凋亡(P0.05),并呈现剂量相关性。mGC中高表达miR-132后可以明显下调ERa蛋白的表达,而对ERβ的蛋白则无明显作用。小鼠卵巢中Foxal蛋白主要表达于各级卵泡的颗粒细胞中;出生后21天小鼠给予PMSG (5 IU/只)刺激后,卵巢生长卵泡的颗粒细胞中Foxal的免疫组织化学信号明显减弱。与对照组相比,miR-132可显著抑制pmirGLO-luc-Foxa1 3'-UTR荧光素酶活性达45%(P0.05),并且抑制Foxal蛋白表达的表达水平,证明miR-132直接转录后抑制Foxal基因的表达。特异性siFoxal沉默内源性Foxal基因表达后,Western blot结果显示凋亡细胞中ERa表达相应减少,mGC凋亡亦明显增加(P0.001)。细胞免疫荧光实验显示外源性高表达miR-132还可以促进ERa蛋白由细胞核内向mGC细胞浆中分散。结论:miR-132通过直接靶向抑制mGC中Foxa1的基因表达,下调ERa水平,并促进ERa核输出,诱导mGC凋亡。


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