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拟南芥液泡磷转运体的分子鉴定及其功能研究

刘金隆  
【摘要】:磷是植物生长发育所必需的大量元素,然而土壤中有效磷浓度往往很低,这常常成为现代农业生产中的限制因素。因此,在实际生产中往往会通过施加大量的磷来提高作物的产量。但是,磷属不可再生资源,依现在的速度在不久的将来将会开发殆尽,而且,大量施加磷也会引起水体富营养化等环境问题。如何提高植物的磷素利用效率已是一个迫在眉睫的问题。充分了解植物吸收、转运和累积无机磷(Pi)的机制是提高植物磷素利用效率的基本前提。目前已知质膜定位的PHT1家族成员主要负责Pi的吸收,高尔基体定位的PHO1主要负责将Pi向木质部中装载以进行长距离运输,线粒体和叶绿体定位的Pi转运体也均有被发现。植物中大部分Pi都储存于液泡中,这对于维持细胞的磷素平衡至关重要,然而,负责液泡Pi储存的转运体还完全不清楚。由于砷酸盐[As(V)]与Pi具有极为相似的物理化学性质,它可竞争性地与Pi转运体结合而进入植物体内,危害人类健康。目前,砷污染已成为一个严重的全球性问题,如何减少砷在作物体内累积也是一个亟待解决的重要课题。已有大量的研究显示质膜上的PHT1家族成员介导了As(V)进入植物体内,然而,内膜系统上的Pi转运体在改变Pi平衡的同时,是否对As(V)的吸收也有重要影响还并不清楚。本论文利用生物信息学、植物分子遗传学、荧光蛋白分子定位和膜片钳技术等方法,首次发现位于拟南芥液泡膜上的一个负责磷储存的转运体,并将其命名为VPT1 (Vacuolar Phosphate Transporter 1)。进一步,我们通过基因敲除突变体、过表达植株和瞬时诱导表达体系等方法,首次发现定位于内膜系统上的VPT1对植物的耐砷性及砷吸收和累积的也有重要影响,并从对PHT1家族成员的反馈表达调控方面做出了解释。我们获得的主要结果如下:1.挖掘到进化高度保守的SPX-MFS家族成员VPT 1是拟南芥适应各种Pi环境的关键组分。考虑到磷是各种生物体生长发育所必需的元素,转运Pi的相关蛋白具有进化保守性,因此,利用生物信息学预测和拟南芥突变体库筛选,并结合生长表型分析,筛选到控制拟南芥适应各种Pi环境的关键基因VPT1。A.预测到拟南芥中三个具有12个跨膜结构SPX-MFS家族成员可能为液泡膜上的磷素转运体。通过与酵母液泡磷转运体ScVTCs和ScPH091的亲缘关系分析来看,我们推测拟南芥SPX-MFS家族蛋白可能是液泡磷转运体。B.拟南芥SPX-MFS家族成员VPT1突变体在土培条件下出现生长异常的表型。我们首先筛选到了Atlg63010 (VPT1)和At4g22990的T-DNA插入敲除突变体。在正常土培条件下,我们发现vptl突变体生长矮小,而且出现早花的现象,于是它被选定为随后的研究材料。进一步,我们通过VPT1的全长基因成功回补了vptl突变体的表型。C. vptl突变体对高低磷的适应都出现严重的缺陷。我们首先在水培条件下进行了磷梯度实验,发现突变体vptl对高磷非常敏感。然后在1/2 MS琼脂培养基上同样得到了类似的表型。当从磷充分的水培条件下移栽至磷缺乏条件下后,突变体vptl的缺磷症状较野生型更为严重,相应地,累积了更多的花青素。2.VPT1为植物对Pi的累积和分配所必需。为了鉴定VPT1的分子功能,我们首先对vptl突变体内的Pi含量进行了测定,然后根据VPT1的基因表达模式,分析了VPT1在拟南芥对磷素适应中的作用。A.突变体vptl体内Pi含量一直维持在一个较低的水平。在我们的磷梯度实验中,除了在极低的磷条件下突变体vptl的Pi含量与野生型没有明显差异以外,其它磷浓度条件下突变体vptl的Pi含量均较野生型更低,尤其是在高磷条件差异更为明显。当向水培液中施加更高的Pi浓度,野生型能够对Pi进行有效累积,然而,突变体却不能。B.VPT1优先在幼嫩组织中表达,并且通过在老叶中的强烈诱导表达来解除高磷对嫩叶的毒害。我们通过对pVPT1::GUS转基因植株的组织化学染色清楚地显示,VPT1主要在幼嫩组织中表达,如根尖和幼叶。与之对应的是,幼叶中的Pi含量也较其它叶片中的要高一些。通过实时定量PCR分析发现,VPT1在叶片和根中均受高磷诱导表达,而在叶片中又以老叶为主。与之对应的是,高磷引起的Pi累积也主要发生在较老的叶片当中。3.确认VPT1为定位于液泡膜上负责Pi吸收的转运体。通过vptl突变体的高磷敏感和低磷含量的生理学特征,我们推测VPT1是一个负责液泡磷储存的转运体。因此,我们对VPT1进行了精确的亚细胞定位,并通过膜片钳技术对VPT1的分子功能进行了充分的验证。A.VPT1为定位于液泡膜上。首先我们通过激光共聚焦显微镜对表达有VPT1-GFP融合蛋白的转基植株进行了观察,质膜荧光染料FM4-64所发出的红色荧光信号与VPT-GFP发出的绿色荧光信号完全不重叠。然后,我们对同时表达有VPT1-GFP和液泡膜标记蛋白y-TIP-mCherry融合蛋白的转基因植株进行了观察,发现它们的荧光信号完全重叠。最后,我们对表达有VPT1-GFP的叶肉细胞液泡进行了分离,更为清楚地显示了VPT1的确定位于液泡膜上。B.VPT1为液泡膜上负责Pi吸收的转运体。我们通过膜片钳技术对vptl突变体或者过表达有VPT1-GFP的烟草叶肉细胞的全液泡进行了内向磷电流记录。结果分析显示VPT1介导了很强的Pi内向电流,并且具有明显的细胞质Pi浓度依赖性。离子选择性分析发现VPT1还能转运SO42-、NO3-、Cl和苹果酸,但它们都较Pi弱。进一步,我们又对VPT1单通道性质进行了分析,发现它的开放概率随着液泡膜的跨膜电位的增加而增加。这些结果充分证实了VPT1为一个位于液泡膜上主要负责Pi吸收的重要的磷转运体。4.VPT1反馈调控着拟南芥对砷酸盐的吸收和累积。VPT1的遗传缺失会导致细胞质内的Pi不能有效地向液泡中转运,因此,在磷充分条件下它很容易处于过量状态。但是,细胞质内较高的Pi水平不仅有利于拮抗As(V)的竞争性毒害作用,还能够反馈抑制质膜上的PHT1家族成员的表达,从而降低植物对As(Ⅴ)的吸收。A.VPT1缺失以后会反馈抑制PHT1s家族基因的表达。在磷充分的条件下,vptl突变体中的两个重要的质膜Pi/As(V)转运体基因PHT1;1和PHT1;4的表达水平均较野生型中的低很多。相应的,PHT1;1的转录抑制因子WRKY6和转录激活因子WRKY45的基因表达水平在vptl突变体中分别较野生型的更高和更低。B.VPT1影响着拟南芥的耐As(V)胁迫能力,但它依赖于环境中的磷浓度。与野生型相比,在磷充分的条件下突变体vptl表现出明显的耐As(V)胁迫的表型,而VPT1过表达植株却对As(V)肋迫更为敏感。然而,低磷条件下VPT1引起的这些As(V)敏感性变化几乎完全消失。C.VPT1影响着拟南芥对As(V)的吸收和累积。在磷充分条件下,与野生型相比,短期As(V)处理后突变体vptl体内累积更少的砷,而VPT1过表植株却累积了更多的砷。长期的低浓度As(V)处理以后,突变体vptl的果荚中有更低的砷,但这在VPT1过表达植株果荚中却完全相反。因此,液泡磷转运体VPT1不仅对植物的磷环境适应性非常重要,而且对植物的砷酸盐吸收也有重要的反馈调控作用。本研究不仅揭示了一个全新的转运体的生物学功能,还为磷素高效利用和低砷高品质作物的分子育种提供了一个新的重要途径。


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