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特定蛋白上磷酸化和泛素化同时原位成像

马凤娇  
【摘要】:磷酸化和泛素化是蛋白翻译后修饰的最普遍两个过程。这两种可逆共价修饰可以依次或同时结合改变蛋白质的功能和定位。更重要的是,大多数情况下蛋白质泛素化的调节依赖于蛋白质磷酸化。为了精确调节细胞内蛋白质的功能,同时监测磷酸化和泛素化是至关重要的。分析蛋白质磷酸化或/和泛素化通常采用仪器方法进行质谱分析和使用抗体进行蛋白质印迹分析。但是,由于体外富集的局限性,这些方法不能原位检测磷酸化和泛素化过程。荧光探针是生物技术中理想的分析方法,所以开发了一些用于特异性检测磷酸化和泛素化的荧光探针。然而,这些探针只能检测一种后修饰过程(单独磷酸化或泛素化)。至今还没有开发出特异性探针用于同时原位监测磷酸化和泛素化的方法。镧系元素掺杂的上转换纳米粒子UCNPs利用近红外区域中多个光子的连续吸收产生短波长发射,可提供近红外激发的多色发射,用于多种目标物的同时检测。在本论文中,我们选用HER2蛋白(一种调控细胞分化和增殖的人类EGFR家族中的跨膜酪氨酸激酶受体)为模型,制备了双发射UCNP,用于同时原位分析细胞膜上特定蛋白的磷酸化和泛素化。HER2可以在活细胞表面上被适配体功能化的UCNP识别,之后通过合成的花青素3(Cy3)连接的双核锌(Ⅱ)荧光分子探针和花青素5.5(Cy5.5)连接的泛素抗体分别识别HER2蛋白上的磷酸化和泛素化。在980 nm的单一激发下,UCNP的两个能量发射带作为两个独立的能量供体,通过发光共振能量转移使与HER2相连的Cy3和Cy5.5受体荧光点亮,用于磷酸化和泛素化的同时成像。此外,磷酸化和泛素化的相对含量可清楚地显示它们之间的相互作用,因此提供了蛋白质降解相关凋亡途径的新见解。


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