置换法构建的纳米红细胞用于增效放疗的研究

【摘要】：肿瘤缺氧引起的治疗抗性,是限制放射治疗(RT)效率的关键因素,并最终导致肿瘤的复发和转移。为了缓解肿瘤的乏氧微环境,已开展了许多基于血红蛋白类氧载体(HBOC)的研究,为具有放疗抗性的癌症患者提供了新的选择。然而,血红蛋白(Hb)中血红素的潜在自氧化细胞毒性和肾毒性阻碍了它们的临床应用,大多研究停滞在临床I期。因此,亟需找到一种安全可靠的新型血红蛋白类氧载体。在本文中,我们通过“置换法”构建了一种具有多重优异性能的纳米红细胞(nnRBCs)。具体方法为:用全氟萘烷(FDC,一种具有极强疏水性、高携氧的全氟化合物)置换掉血红蛋白中的血红素,得到全氟萘烷-珠蛋白纳米复合物(NPs),然后在其外侧涂覆一层红细胞膜(RBCm),制备得到nnRBCs。本文研究内容主要分为四个部分:第一部分nnRBCs的制备工艺探索和体外表征。以血红蛋白为原材料,通过经典的酸性丙酮法收集得到珠蛋白。通过比较泊洛沙姆、白蛋白、脂质体和珠蛋白4种不同的乳化剂乳化FDC后粒径的大小,确定珠蛋白为最合适的乳化剂。接下来筛选了 RBCm和NPs的体积比,确定以4:1的比例共挤滤膜制备的nnRBCs粒径最小,稳定性最佳。然后,通过粒径测定、电势测定、透射电镜图像和凝胶电泳图像证明RBCm在NPs表明的的成功包裹。紫外定性和定量的方法确定体系中血红素被彻底去除,气相色谱仪测定了体系中FDC的包载量,最终考察了nnRBCs在不同介质和温度中的粒子稳定性。我们的结果反映出nnRBCs具备高载药量、长期稳定和安全性良好的优点。第二部分nnRBCs的释氧行为和细胞毒性表征。通过氧电极测定nnRBCs的携氧量,之后在体外模拟了体内的乏氧微环境和常氧微环境,氧电极监测nnRBCs和其他几种制剂的释氧过程。直观通过血液颜色的变化鉴定nnRBCs对血氧饱和度的改变。然后在结肠癌肿瘤细胞模型上,测试了 nnRBCs对细胞缺氧状态、对DNA分子损伤以及对细胞放疗毒性的影响。最终结果呈现出nnRBCs可以在体外有效改善乏氧并辅助增强放疗造成的细胞的破坏和损伤。第三部分nnRBCs对肿瘤乏氧改善的表征。在CT26结肠癌小鼠模型中,通过免疫荧光染色和western blot实验,研究了 nnRBCs静脉注射后肿瘤内乏氧强度和HIF-1α蛋白表达的变化。然后,对HIF-1α下游和肿瘤发展相关的基因的含量进行了定量。这些结果共同表明了 nnRBCs可以很好的缓解肿瘤中的乏氧,并下调由乏氧引起的促肿瘤进展的基因的表达。第四部分nnRBCs的放疗增效和安全性的研究。本部分在CT26结肠癌皮下肿瘤模型中开展了药效评估,nnRBCs联合RT后起到了1+12的效果,显著地限制了肿瘤的生长。通过血清生化分析和切片染色观察评价了 nnRBCs对肾功能的影响,结果显示nnRBCs具有高度的安全性。nnRBCs为FDC的输送提供了一种新的方法,因为在此之前它不能被任何FDA批准的乳化剂乳化。在静脉内递送后,nnRBCs通过有效地逆转肿瘤缺氧而提高了 RT的效率。值得注意的是,nnRBCs的成分全部来自生物体或通过人体试验验证的安全物质,这使得nnRBCs具有快速进入临床试验的巨大潜力。