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高效能量转移型上转换纳米探针构建及其在基质金属蛋白酶分泌检测中的应用

何蓉  
【摘要】:基质金属蛋白酶(MMPs)是一类锌依赖的肽链内切酶家族,通过分泌到细胞外执行降解细胞外基质和基底膜的功能,在肿瘤侵袭和转移过程中发挥着至关重要的作用。因此,实现对基质金属蛋白酶的原位成像及定量分析对评价肿瘤细胞的侵袭性及疾病的诊断具有重要的意义。目前常用的基质金属蛋白酶分泌检测方法均依赖于上清液中的均相测定,难以实现对MMPs分泌的实时监测且不能体现细胞个体差异。针对这一问题,我们构建了基于发光共振能量转移(LRET)策略的细胞膜靶向上转换纳米探针,实现了在细胞膜局域空间内对MMPs分泌的原位成像及定量检测,为细胞分泌的原位监测提供了新的研究思路。本论文主要包括以下两个部分:1.高效能量转移型上转换纳米探针的构建本章通过在酸性条件下共价结合阿仑膦酸钠小分子(DIP)对油相上转换纳米颗粒进行表面亲水改性及表面氨基功能化,再进一步修饰染料Cy3作为能量转移中继站,同时修饰末端标记有Cy3淬灭剂的多肽链,在近红外光照下UCNP发光激发Cy3,Cy3继而被长链末端淬灭剂淬灭,由此实现了由上转换纳米材料内部发光到染料中继站Cy3,再到多肽末端淬灭剂的两个连续短距离LRET过程,提高了从UCNP内部发光到表面远距离修饰的能量受体之间的长程能量转移效率。首先在酸性条件下去掉上转换纳米粒子表面的油酸配体,再通过DIP中的双磷配体与上转换纳米粒子表面三价稀土离子间强的配位作用共价结合上DIP;随后通过酰胺反应共价结合上中继站Cy3染料,由此实现了能量供体UCNPs与能量受体Cy3之间的第一次LRET过程。通过UCNP表面功能化PEG链进一步修饰末端标记有淬灭剂QSY7的多肽链,并由此实现了中继站染料Cy3与能量受体QSY7之间的第二次LRET过程,Cy3发光被淬灭。由于MMP2对多肽底物具有特异性酶切作用,当发生酶切时,Cy3荧光信号恢复,通过检测荧光信号恢复程度对MMP2实现定量检测。2.基质金属蛋白酶分泌原位成像与定量分析在上转换纳米探针的基础上进一步结合特异性识别细胞膜表面表皮生长因子受体(EGFR)的抗体实现了对MDA-MB-231细胞的靶向,从而通过检测细胞膜局域空间内Cy3发光的恢复程度对细胞分泌的MMP2实现了原位成像与定量分析。首先,基于UCNP表面功能化长链PEG末端NHS共价结合anti-EGFR抗体,通过该抗体与MDA-MB-231细胞膜表面EGFR的特异性抗原-抗体相互作用识别并靶向到细胞膜表面,将探针锚定在细胞膜表面局域空间。加入脂多糖刺激MDA-MB-231细胞分泌MMP2,在细胞膜表面局域空间内结合的UCNP纳米探针发生多肽底物的酶切水解作用,导致多肽末端的QSY7随着切断的多肽残链离开上转换表面,Cy3发光恢复,在细胞膜表面局域空间内实现了对MMP2分泌的原位灵敏快速响应。这一方法实现了在细胞膜表面局域空间内原位快速地对活细胞分泌的MMP2进行动态监测,为灵敏快速检测其他细胞分泌物提供了一种新的方法,在定性定量原位分析细胞分泌物研究中有潜在的应用价值。


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