功能化DNA纳米自组装体的构建及其在癌症诊疗中的应用

【摘要】：癌症是当代医学的难题,严重威胁着人类的健康和生命。一般而言,癌症的发生往往与某些特征标记物的表达息息相关。然而,这些标记物在细胞内的表达量过低,常规检测方法往往得不到满意的结果。因此,开发具有信号放大功能的高灵敏检测探针,对这些特征标记物的早期检测具有十分重要的意义。另一方面,就癌症治疗而言,目前发展了一系列有机或无机纳米材料用于药物递送体系的构建。然而,这些纳米材料仍受到明显的细胞毒性、结构不稳定性和非特异性的挑战。此外,复杂的制备过程,也在很大程度上限制了它们的临床应用。近年来DNA纳米材料因其优异的生物相容性,可编程性,且易于修饰等特点被广泛用于生物分析及药物递送。基于此,本论文拟利用DNA纳米技术构建高灵敏的检测平台,同时开发多功能的新型DNA纳米自组装体用于联合抗癌治疗,并最终实现癌症的诊断和治疗一体化。主要内容如下:1.级联放大介导的原位热点组装用于micro RNA的检测及分子逻辑门的构建:Micro RNAs(mi RNAs)的检测通常是采用单一信号放大策略与多种检测技术相结合的方法。但这些方法往往受限于其灵敏度和选择性低,使得检测结果并不理想。本工作将双链特异性核酸酶(DSN)辅助靶标循环和催化发夹组装(CHA)反应相结合,构建了一种级联信号放大免标记电化学生物传感器用于mi RNA-141的高灵敏检测。该传感器具有出优异的重复性和稳定性,其检测限为25.1 a M,线性范围为0.1 f M-10n M,同时能够准确识别单碱基错配的mi RNA-141。最后,该传感器被成功地用于MDA-MB-231细胞内mi RNA-141的定量检测。在此基础上,本工作还构建了AND和INH两种逻辑门。其中,AND逻辑门可进一步实现癌细胞中mi RNAs的初步定性分析。因此,本工作构建的生物传感器在与mi RNAs相关的临床诊断和生物化学研究中具有巨大的应用潜力。2.多功能的适配体-DNA聚环链纳米载体用于耐药白血病的协同靶向治疗:化疗作为癌症治疗的主要手段之一,由于其传递效率低、副作用较大,尤其是长期使用产生的细胞多药耐药性(MDR)常常导致治疗效果不尽人意。另一方面,尽管已有大量有关DNA纳米结构作为药物载体的报道,但DNA纳米结构的自组装效率低导致其结构成分复杂,且目前的纯化方法(包括离心、透析、凝胶电泳)往往会对其结构产生破坏或污染。在此,本工作利用可循环的磁分离技术构建了一种高纯度的适配体修饰的DNA聚环链(Apt DPCs),并联合化疗和基因治疗,实现了MDR白血病的靶向协同治疗。当负载Dox的Apt DPCs被MDR白血病细胞特异性摄取后,在溶酶体酸性环境下,Dox迅速被释放,并逐渐扩散至细胞核中诱导肿瘤细胞凋亡。同时,反义DNA可特异性地与耐药蛋白(MDR1)的m RNA杂交,抑制其表达,从而防止Dox被泵出,增强MDR肿瘤细胞对药物的敏感性。体内和体外结果证实,Apt DPCs不仅可以实现药物靶向递送,而且可以协同基因治疗显著提高MDR肿瘤的化疗疗效。这为开发耐药肿瘤靶向纳米治疗平台开辟了新的途径,并且在临床领域具有重大意义。3.内源性m RNA触发的DNA-Au纳米机器用于原位成像和靶向多模式协同癌症治疗:癌症的精确诊断和精准治疗是提高癌症患者治愈率的关键。然而,构建一种集诊断和治疗于一体的多功能肿瘤诊疗纳米平台一直是一个棘手的挑战。在此,基于熵驱动的DNA链置换反应,本工作构建了一种多功能DNA纳米机器(Apt-DNA-Au)用于癌症相关生物标志物的原位成像和多模式协同抗肿瘤治疗。所设计的纳米机器以Au NPs为载体,并将三组分DNA杂交体、单链燃料DNA和MUC1适配体通过AuS共价键固定在其表面。当Apt-DNA-Au特异性地进入MCF-7细胞后,在目标物的触发下,通过DNA级联链取代反应Cy5荧光恢复用于目标物的原位成像,从而便于在治疗过程中实时监测肿瘤动态变化。在这个过程中,纳米机器构象的改变及肿瘤部位的酸性环境刺激,有利于化疗药物Dox的精准可控释放。同时,释放的反义DNA可下调生存素蛋白的表达,进行基因治疗。此外,在660 nm激光照射下,聚集的Au NPs和负载在G-四联体中的光敏剂分别产生高温和活性氧,用于光热治疗(PTT)和光动力治疗(PDT)。体内和体外研究表明,Apt-DNA-Au不仅可以联合化疗、基因治疗、PTT、PDT协同治疗乳腺癌,而且有助于肿瘤的精确诊断和成像引导的肿瘤精准治疗,为诊疗一体化纳米平台的开发提供了新思路。