人参皂甙Rg1强化嗅鞘细胞生物学行为的实验研究

【摘要】：目的:1、建立一种经济实用、易重复、细胞培养周期短、产量大的嗅鞘细胞培养、纯化方法。2、研究人参皂甙Rg1对嗅鞘细胞(OECs)增殖及相关神经营养因子(NTFs)表达、分泌等生物学行为的影响,寻找OECs有临床应用前景的调节因子。为OECs移植修复脊髓损伤更好解决种子细胞的来源和生物学活力问题。 方法:1、剪切吹打分散法接种嗅鞘细胞及三步顺序法纯化培养:从成年SD大鼠解剖分离嗅球,显微镜下剥离软脑膜、剔除中央白质,将灰质成分置于含10%胎牛血清的DMEM/F12全培养基,眼科剪剪切至组织成糜状,吸管吹打15-20次,混悬液免胰酶消化直接接种培养,每三天半量换液。原代培养至细胞大部分融合后,依次以低浓度胰酶(0.05%)有限消化法、30min短时差速贴壁法、抗有丝分裂法三步顺序纯化细胞,每步纯化结果作共聚焦免疫荧光染色鉴定。2、研究Rg1对嗅鞘细胞增殖的影响MTT法:OECs鉴定纯化后分组, Rg1以浓度梯度0(空白对照)、10、20、40、80μg/ml分别干预细胞24 h、48 h、72 h、96 h,MTT染色OD值绘制生长趋势图,得出Rg1对OECs作用的最适浓度和最适作用时间的结论,并作为以下所有实验步骤的基础,以此策略干预细胞;Brdu测24 h细胞增殖率:细胞分三组,空白对照组,Rg1组,Forskolin阳性参照组,BrdU免疫荧光染色法测细胞增殖率。3、研究Rg1对OECs相关NTFs表达和分泌的影响RT-PCR:细胞纯化鉴定后分两组,一组对照,一组Rg1的最适浓度和时间干预,通过RT-PCR电泳条带对比亮度法分析Rg1对OECs胶质源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor ,GDNF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor ,BDNF)、神经生长因子(nerve growth factor ,NGF)mRNA表达的影响; ELISA试剂盒:分别测上述两组细胞培养上清内GDNF、BDNF、NGF的含量,并作统计学分析。 结果:1、细胞取材接种过程较传统方法大大简化,由60-90 min多步骤过程简化为8-10 min一步完成,原代培养中嗅鞘细胞快速贴壁成为优势细胞、生长旺盛,三步顺序纯化过程细胞纯度逐步提高,以最小代价、最少细胞损耗获得纯度提升,最终鉴定纯度可达95%以上并长时间维持。2、Rg1促进嗅鞘细胞增殖,获得峰值效应;24 h增殖率:空白对照组9%,Rg1组17%,差异有统计学意义(P0.05);Forskolin组20%,同Rg1组差异无统计学意义(P0.05)。3、RT-RCR分析显示Rg1干预组细胞GDNF、BDNF、NGF的mRNA较对照组表达显著上调,差异有统计学意义(P0.05);ELISA法测Rg1组培养上清GDNF、BDNF、NGF分泌量较对照组显著增加,差异有统计学意义(P0.05)。 结论:1、免消化剪切吹打分散法接种OECs及其三步顺序法纯化培养方法经济实用、易重复,细胞培养周期短,革新了传统培养纯化方法,能收获大量可控纯度的嗅鞘细胞供进一步移植实验及基础研究。2、Rg1促进OECs增殖及其GDNF、BDNF、NGF三种关键NTFs的mRNA表达上调、分泌增加,因而正调节OECs的生物学行为。3、本研究更好地解决了OECs的来源和生物学活性问题,为脊髓损伤的细胞移植治疗提供更多更好的种子细胞。