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家蚕类胰岛素基因BBX-B8的功能研究

郑小坚  
【摘要】:胰岛素/类胰岛素生长因子信号通路在所有多细胞有机体的生长和发育,繁殖,抗逆性,新陈代谢和寿命等生物学方面扮演着重要角色。昆虫类胰岛素肽(Insulin-like peptides,ILPs)种类多样,在脑和其它组织中由多基因家族编码并表达,与脊椎动物胰岛素结构组成非常相似但功能却不相同。 家蚕为鳞翅目昆虫的模式种,家蚕蚕素(Bombyxin,BBX)是首次发现的昆虫类胰岛素,拥有7个(A~G)家族38个成员,是昆虫ILPs功能研究的良好材料。家蚕BBX B族的B8基因(BBX-B8),编码88个氨基酸残基,在家蚕脑神经分泌细胞高水平表达。业已明确,家蚕BBX具有促进造血器官细胞增殖、参与糖代谢、调控蓖麻蚕前胸腺的分泌活性。为进一步探讨BBX-B8基因的功能,采用RNAi和转基因技术,较系统地研究上调、下调BBX-B8表达水平对家蚕生长发育、抗逆性、化性、丝蛋白合成等方面的影响。在克隆BBX-B8 cDNA的基础上,通过RT-PCR检测到了BBX-B8在家蚕脑、卵巢、精巢、中肠、前部丝腺、马氏管、脂肪体和胚胎等组织中有不同程度的表达,而翅原基、卵黄中未检测到BBX-B8的mRNA,表明家蚕BBX-B8的表达具有组织特异性;Western boltting测定结果显示,5龄3 d脑组织中BBX-B8水平较低,5 d起明显上升。将体外转录合成的BBX-B8 dsRNA腹注5龄3 d家蚕,sqRT-PCR和Western boltting检测结果显示,注射3 d后脑中BBX mRNA水平的下降程度依赖于dsRNA的注射剂量,10μg/头注射区脑组织中BBX水平下降约30%。证实BBX-B8 dsRNA对家蚕BBX基因有表达抑制效应。以此BBX-B8 RNAi家蚕模型对BBX功能的研究结果显示,5龄3 d注射BBX-B8 dsRNA,蛹翅原基发育受阻,畸形翅增多,成虫脑的形态发育明显延缓;注射2 d后进行高温(40℃3 h)和低温(4℃3 h)冲击,化蛹率比对照区提高12.76%;注射后禁食处理,饥饿状态下的化蛹率比对照区低9.29%;注射3 d后,血淋巴中SOD活性、T-AOC分别提高17.81%、41.86%,而CAT活性与对照无显著差异;血淋巴中海藻糖和海藻糖酶的水平分别上升12.68%和68.24%。化蛹1d后的蚕蛹注射BBX-B8 dsRNA(10、15μg/10μL·头),其造卵量分别增加7.86%和12.62%。 将家蚕BBX-B8w(野生型)和BBX-B8m(改造型)基因克隆进昆虫非转座子载体pIZT/V5-6His中,构建转基因重组载体pIZT/V5-B8w和pIZT/V5-B8m,分别转化家蚕BmN细胞,经Zeocin筛选和分子生物学鉴定获得转化细胞B8w和B8m;调查结果显示B8w和B8m的生长稍慢于正常BmN细胞,对杆状病毒Bm-BacPAK6的感染性B8w和B8m与正常BmN细胞之间无明显差异。采用精子介导法将转基因载体pIZT/V5-B8w导入家蚕基因组,通过荧光筛选和分子生物学方法鉴定获得了BBX-B8w转基因家蚕。研究结果显示,转基因家蚕脑提取液促进除脑蓖麻蛹羽化的活性高于正常家蚕的脑提取液;转基因家蚕的发育延迟2-8 d,蛹体重减轻,丝蛋白的合成能力下降,且对雄蚕的影响大于雌蚕;有5.56%~14.29%的转基因蛾产下非滞育卵。提示BBX-B8是家蚕的一个重要的发育调节因子,影响蚕的组织器官发育、化性、抗逆性、产卵量、个体大小、丝蛋白合成,承担多种独特的生物学功能。


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