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人脑胶质瘤组织原位移植模型的改良及高侵袭性人脑胶质瘤干祖细胞株的建立及其特征分析

费喜峰  
【摘要】:第一部分建立人脑胶质瘤组织原位移植模型方法的改良及亲本性分析 目的人脑胶质瘤移植既往以皮下为主,因异位生长模拟性有限,目前主张行脑原位移植,以提高模拟性。但因涉及神经中枢,创伤大,成功率低,需要摸索新的创伤小、成功率高的方法。本研究是接着课题组前期已经建立,但仍需改进的一种组织块直接穿刺注入方法的基础上,旨在作进一步改进,并推向国际。 方法(1)从不同型号的医用静脉穿刺留置针中筛选适合小鼠脑穿刺的针,预留进入鼠脑的深度后加上外套管,组合成小鼠脑移植专用针;(2)将肿瘤组织块填充入脑移植专用针管内的组织推进器;(3)用市场购置的颅骨微型钻钻颅代替开颅;(4)将移植用的临床病人或传代的可移植性胶质瘤组织,置于培养液内剪成碎粒后,用组织推进器置入接种专用针,经钻颅孔刺入脑尾状核;(5)护理荷瘤鼠,记录临床表现,观察致瘤率、移植瘤组织病理、分子免疫病理、MR显像和荷瘤鼠生存期。 结果(1)荷瘤鼠早期没有明显的临床症状,活动和纳食不受影响。晚期,纳食减少,体形消瘦,反应迟纯,呈恶液质状态。一旦出现恶液质,一般持续2d死亡。另外一种特点是,即使肿瘤长得很大也很少有偏瘫和抽搐发作;(2)取临床标本作初代接种,不易成功。成功率与被接种肿瘤的恶性程度和所取肿瘤组织的活力有关,我们总的移植成功率在50%左右。但在可移植性肿瘤组织块鼠间传代的致瘤率,在第三代后稳定在100%,荷瘤鼠生存期23.9±1.7d,从第五代开始逐渐稳定;(3)移植瘤较好地保持了肿瘤细胞的亲本性,可检测到CD133~+和SOX2~+肿瘤干细胞,增殖细胞Ki67~+细胞,胶质细胞特异的GFAP~+瘤细胞和转移性腺癌特征的CEA~+细胞。 结论国际上,人脑胶质瘤组织块免疫功能缺陷小鼠原位接种是采用开颅法将肿瘤块埋在硬脑膜下腔,不但创伤大,操作复杂,而且移植瘤以脑外增殖为主,与几乎都在脑内增殖的胶质瘤不相似,并不是真正意义上的脑原位移植;本实验原创的组织块直接注入裸小鼠脑内建立的实验动物模型,创伤小、成功率高,制作方法相对简易,并由于移植瘤真正长在脑内,能更好地保持亲本肿瘤的特征。这种新方法,已在SCI收录杂志发表,被业内人士认可,可进一步在各种脑肿瘤动物原位移植实验中推广应用。 第二部分高侵袭性胶质瘤干祖细胞株SU3的建立及其在裸小鼠不同部位移植瘤的增殖与侵袭特征的观察 目的(1)在临床上,高侵袭性是高度恶性胶质瘤的基本特征之一,其侵袭程度随着肿瘤恶性级别增高而增加。但既往用胶质瘤传代培养的细胞系行裸小鼠脑内接种的方法来进行验证存在一定的困难,因为这种方法形成的移植瘤往往呈相对局灶性生长,与临床病理大相径庭。即使用胶质瘤干细胞移植,原发和继发者的侵袭程度也有不同。本部分旨在建立一个模拟性好的高侵袭性胶质瘤体内外模型,为进一步研究胶质瘤干细胞对宿主组织的侵袭特征奠定基础;(2)目前对胶质瘤生物学特性研究非常重视微生态环境的影响,接种在不同部位的胶质瘤细胞,是否因宿主提供的微生态环境不同而受到影响,是本部分研究的第二个目的所在。 方法(1)参照核磁共振图像(MRI)上呈高侵袭生长、在侵袭明显的播散病灶中取手术活检标本2份,一份送病理科快速诊断;另一份制成单细胞悬液,在干细胞培养液、5%CO_2条件下培养7d,收集悬浮生长的肿瘤球,消化成单细胞,用有限稀释法将肿瘤细胞球中的细胞进行单克隆化;(2)挑选若干个克隆球进行CD133,nestin,GFAP等干细胞、祖细胞、胶质细胞等相关标记物免疫组化检测,筛选出符合干细胞特征的肿瘤球进行传代和液氮保存;(3)将液氮保存的肿瘤球复苏后一部分接种至细胞培养的6孔板做划痕试验,确定肿瘤干细胞的侵袭能力;(4)另一部分细胞接种于裸小鼠的颅内、皮下和腹腔,观察不同部位的致瘤率;(5)对不同部位的移植瘤行肉眼观察,石蜡包埋,切片后进行HE和免疫组化染色,镜下观察移植瘤的侵袭性和病理特点。 结果(1)SU3的干性和多向分化潜能:呈悬浮生长的肿瘤球的相关标记物免疫组化结果表明,CD133~+和nestin~+细胞分别占7%和85%,微弱表达GFAP;分化条件下培养的肿瘤细胞nestin~+和GFAP~+细胞分别占82%和73%,但未检测到CD133~+细胞;(2)致瘤率和生存期:将呈球状生长的胶质瘤干祖细胞接种在裸小鼠脑内(尾状核),致瘤率为90.48%(19/21只),生存期为35.5±0.94d;接种于腹腔致瘤率为87.5%(7/8只),生存期为52.20±1.31d;接种于皮下致瘤率为80%(8/10只),生存期为50.75±0.75d;(3)肿瘤侵袭性:脑内,SU3从接种点(尾状核)向四周扩散,呈播散性生长,可到达纹状体,海马,进入脑室系统,同侧半球的髓质,皮质和脑膜。一部分还可向对侧半球,嗅脑,甚至向脑外生长。少数可形成肿瘤性脑积水;皮下,肿瘤呈巨块形,早期有伪包膜,中期肿瘤侵袭皮肤,肌肉和肋骨,晚期肿瘤可发生不愈合的溃疡;腹腔,肿瘤细胞可在大网膜,肠系膜,腹膜和腹腔中几乎所有脏器上定居和增殖,在形成实体瘤的同时,还可形成癌性血液样腹水,腹水中的癌细胞可在体外传代培养,再接种裸小鼠仍有致瘤性;(4)组织病理:发现SU3细胞在不同的定居点生长,受当地的微生态环境的影响,移植瘤的组织结构,甚至特异性标记物的表达有拟寄生地的宿主组织细胞类型生长之潜能,至少在脑室脉络膜丛上的SU3长成了类似脉络膜癌;在肝组织内的SU3长成了类似肝细胞癌。 结论(1)建立的SU3细胞株,从生物学,组织病理学和分子标记物层面证明是一株具有高侵袭特征的胶质瘤干祖细胞,对进一步研究胶质瘤发生,发展,特别是侵袭机制有重要意义;(2)从SU3拟寄生地宿主组织细胞类似的肿瘤类型生长来看,揭示了肿瘤细胞在对宿主组织重构过程中,肿瘤细胞与宿主细胞的作用是双向的,说明肿瘤干细胞的多向分化潜能不都是按既定目标走的,可以按微环境需要而作一定程度的修饰。这对进一步研究肿瘤干细胞是否是全能的种子细胞发出了挑战,对进一步辩正地分析肿瘤发生学中“种子与土壤”学说有重要意义。 第三部分与胶质瘤干祖细胞侵袭性相关的干性标记蛋白表达、干细胞巢和肿瘤血管形成的分子表型分析 目的肿瘤标记物检测对肿瘤生物学特征研究具有举足轻重的作用,如果1989年Kahler等于多发性骨髓瘤患者体内检测到的Bence-Jones蛋白质是第一个肿瘤细胞特异性标记物的话,那么在长达20年的时间里,实体瘤的肿瘤特异标记物的研究进展不尽如人意。就胶质瘤而言,呈侵袭性生长的生物学特征决定了他的恶性表型、难治性和不良预后。目前,与侵袭性相关的蛋白质标记知之不少,但与干祖细胞的关系欠明确,而且还有新的干祖细胞标记物陆续涌现,提示在这一领域中值得进一步探索。本部分旨在分析高侵袭性胶质瘤干祖细胞SU3移植瘤的分子表型,与干细胞巢的构建和肿瘤血管生成的关系,为进一步研究胶质瘤细胞侵袭性生长机制奠定基础。 方法按本文第二部分的方法,将高侵袭性的SU3细胞悬液接种至裸小鼠颅内和腹腔,与此同时将低侵袭的U87MG细胞悬液接种至另一部分裸小鼠颅内,作为对照。对颅内移植者,出现肿瘤晚期的恶液质情况时处死、取全脑;对腹腔移植者,腹围明显增大,有腹水后处死,取肿瘤结节。对移植瘤行石蜡包埋,切片后进行干细胞相关标记物、血管内皮相关标记物和侵袭相关标记物的常规免疫组化染色,观察他们在不同样本中的表达情况,并与临床样本进行比较。相关标记物的表达率和表达强度判定标准:抗原抗体复合物,根据抗原表达强度呈深浅不等的棕色,根据表达部位不同,可在细胞膜、细胞浆和细胞核中见到。为了证实其中有些标记物与肿瘤血管形成与血液运输功能的关系,特地研制了炭颗粒混悬液心腔灌注法,对包括肿瘤血管在内的全身血液循环进行示踪。 结果(1)干细胞相关标记物:SU3移植瘤高表达CD133和SOX2,低表达nestin,几乎不表达GFAP。U87MG移植瘤低表达CD133、SOX2和GFAP,高表达nestin;(2)CD133~+细胞表型与肿瘤干细胞巢:无论在脑内还是皮下一部分CD133~+细胞成簇生长,可以界定为干细胞巢,并发现与血管的关系密切;(3)CD31~+细胞与肿瘤血管: CD31蛋白质可以表达于形态像肿瘤细胞的细胞,但表达于形态像内皮细胞的细胞占绝对多数,也有一部分表达于从肿瘤细胞向内皮细胞转化的过渡细胞。由CD31~+细胞组成的管腔中因有炭颗粒而证明这些细胞形成了血管;(4)侵袭与增殖相关蛋白质MMP2、MMP9和Ki67的表达均为SU3移植瘤组织高于U87MG移植瘤组织。 结论来源于肿瘤患者播散灶中的SU3干祖细胞形成的移植瘤能保持亲本肿瘤高侵袭性特征,其分子机制与其较好地保留了干细胞标记蛋白CD133、SOX2和基质金属蛋白酶MMP2、MMP9高表达直接有关。但也可能与其有效地调控了决定干细胞命运的niche生成和肿瘤血管形成有关。


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