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CD40信号调控胃癌免疫编辑的作用及机制

李锐  
【摘要】:目的探讨CD40在胃癌组织中的表达及其与胃癌患者预后转归的关系。方法采用免疫组化法检测73例胃癌组织和51例正常胃黏膜组织中CD40的表达,利用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)法分别检测11例胃癌和正常胃黏膜组织中CD40 mRNA的表达。应用Kaplan-Meier法和Log—rank检验评价CD40与胃癌患者生存时间的关系,并用Cox风险模型进行多因素分析。结果免疫组化检测显示CD40在胃癌组织中的阳性表达率为47.9%(35/73),与正常胃黏膜组织相比,差异有统计学意义(P=0.0063);RT-PCR检测发现CD40 mRNA在胃癌组织中的阳性表达率为72.7%(8/11),在正常胃黏膜组织中无表达。随访5年后,CD40阴性组存活57.9%(22/38),CD40阳性组存活5.7%(2/35),差异有统计学意义(P=0.0022)。胃癌组织中CD40阴性表达、弱~中等阳性表达和强阳性表达患者中位生存时间分别为56、29和11个月,生存率差异有统计学意义(P=0.0085)。Cox回归多因素分析显示,CD40表达、淋巴结转移及临床分期是影响胃癌患者预后的独立因素。结论CD40在胃癌组织与正常胃黏膜中差异表达,可能参与胃癌的转移扩散,可作为预测胃癌患者预后的重要指标。 目的对前期研究获得的胃癌AGS细胞CD40信号活化前后基因表达谱进行生物信息学分析,筛选并鉴定与肿瘤免疫编辑相关信号转导通路,进一步构建基因沉默载体,用于特异性阻断相关信号途径,为进一步研究CD40调控胃癌免疫编辑奠定基础。方法前期研究已经获得AGS细胞CD40信号活化前后的基因表达谱芯片,利用层次式系统聚类分析法(Hierarchical Cluster)对差异表达基因群聚类分析,筛选出与胃癌免疫编辑相关的信号转导通路,并采用Real-time PCR和蛋白印迹法(Western blot )验证相关分子表达变化。设计短发夹结构的磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K) siRNA对应模版DNA序列,克隆至Psilencer1.0-U6质粒,构建Psilencer1.0-U6-PI3K-siRNA质粒载体。将重组质粒转染人胃癌AGS细胞,利用免疫荧光染色观察转染情况,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测PI3K表达。结果生物信息学分析结果显示差异表达基因414个,包括上调基因209个,下调基因205个,其中PI3K和JNK/SAPK信号通路相关基因均显著上调,并经Real-time PCR和Western blot检测验证。酶切及测序证实Psilencer1.0-U6-PI3K-siRNA质粒载体构建成功。转染重组质粒后可以显著抑制AGS细胞PI3K mRNA和蛋白表达(P0.05)。结论人胃癌AGS细胞CD40信号活化后可激活多条不同的信号转导通路,其中PI3K/Akt和JNK/SAPK信号通路异常活化可能是CD40信号调控胃癌细胞双重生物学行为的重要分子机制。PI3K/Akt信号通路可诱导Survivin、VEGF等基因表达上调,可能促进胃癌侵袭、转移,参与胃癌免疫编辑。靶向性PI3K siRNA基因沉默载体能特异性抑制PI3K表达。 目的探讨应用小分子干扰RNA ( small interfering RNA, siRNA)沉默磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)基因对CD40信号活化介导的胃癌细胞生长、侵袭及Survivin、VEGF、Fas等相关蛋白表达的影响。方法将已成功构建的重组质粒Psilencer1. 0-U6-PI3K-siRNA稳定转染胃癌AGS细胞。实验共分4组:A. sCD40L+PI3K siRNA细胞组;B. sCD40L+AGS细胞组;C.生理盐水+PI3K siRNA细胞组;D.生理盐水+ AGS细胞组。四氮唑蓝(MTT)比色还原法检测细胞生存率,流式细胞技术检测细胞周期和凋亡率变化,细胞划痕实验和Transwell实验分析细胞侵袭、转移能力,Western blot检测PI3K、Survivin、VEGF及Fas蛋白的表达。结果sCD40L+PI3K siRNA联合干预组较其余各组细胞周期阻滞及凋亡率明显增加,生存率及侵袭、转移能力明显下降, PI3K、Survivin、VEGF表达显著下调,Fas表达显著上调,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论CD40信号活化联合PI3K基因沉默可明显抑制胃癌细胞生长,促进凋亡,抑制肿瘤血管生成。其可能机制在于PI3K siRNA可特异性阻断PI3K/Akt信号通路,下调凋亡抑制蛋白及VEGF蛋白分泌,上调Fas表达。CD40介导PI3K/Akt信号活化可能通过调控Survivin、VEGF及Fas等效应蛋白表达,促进肿瘤免疫对抗/逃逸,参与胃癌免疫编辑。 目的探讨CD40信号活化联合PI3K基因沉默对胃癌裸鼠移植瘤的生长和肿瘤微环境中血管生成及相关蛋白表达的影响。方法选用BALB/c nu/nu裸鼠24只进行体内实验,随机分为4组,每组6只:Ⅰ. sCD40L+PI3K siRNA组;Ⅱ. sCD40L+AGS细胞株组;Ⅲ.生理盐水+PI3K siRNA组;Ⅳ.生理盐水+ AGS细胞株组。取呈对数生长期的AGS细胞、PI3K基因沉默细胞以5×106个细胞/100μl/只分别接种于相应各组裸鼠右胁腹前肢皮下。术后连续观察42d后处死裸鼠。观察并计算各组肿瘤平均体积。测定瘤块中微血管密度(MVD);TUNEL法检测肿瘤的凋亡指数;Western blot检测PI3K、Survivin、Fas及VEGF蛋白表达的变化。结果sCD40L+PI3K siRNA联合干预组肿瘤平均体积较其余各组均明显减小,差异有统计学意义(P0.05)。联合干预组与对照组相比,肿瘤原位凋亡明显增加,MVD明显减小,差异有统计学意义(P0.01)。联合干预组肿瘤组织中PI3K、Survivin、VEGF表达显著下调,Fas表达显著上调,差异有统计学意义(P 0.01~0. 05)。结论CD40信号活化联合PI3K基因沉默能显著抑制胃癌裸鼠移植瘤生长及血管生成,促进凋亡。其可能机制在于PI3K siRNA可特异性阻断PI3K/Akt信号通路,下调肿瘤微环境中凋亡抑制蛋白及VEGF蛋白分泌,上调Fas表达,进而增强CD40信号诱导的特异性抗肿瘤效应。 目的本研究拟提取、纯化黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)并分析其化学结构,探讨APS对胃癌大鼠模型的免疫调节和抑瘤作用,以及对CD40、PI3K信号通路的影响,为临床应用APS调控CD40信号相关胃癌免疫编辑,进行胃癌生物治疗提供实验依据。方法采用NaOH醇提醇沉法从天然黄芪中提取APS。利用薄层色谱法(TLC)和葡聚糖凝胶G色谱法进一步分离、纯化APS。采用高效液相色谱(HPLC)和红外线光谱技术(IR)定量测定APS分子量及分子结构。40只雄性Wistar大鼠分为5组,每组8只,除空白对照组外,其余4组均经免疫抑制处理(注射阿糖胞苷与全身照射60CO),皮下接种胃癌细胞悬液,制成胃癌大鼠模型。其中3组分别用APS低、中、高剂量灌胃治疗,正常对照组和模型对照组分别用相应剂量的生理盐水灌胃。10 d后,观察各组肿瘤生长情况并计算抑瘤率,检测裸鼠脾淋巴细胞能力和NK细胞活性,利用ELISA法测定外周血IgA、IgM、IgG及IL-2等的浓度,流式细胞技术检测胃癌大鼠外周血T细胞亚群含量,Western blot检测各组胃癌大鼠肿瘤组织CD40、PI3K蛋白表达。结果APS能显著提高胃癌大鼠脾淋巴细胞增生率、外周血IL-2水平及NK细胞活性,且呈剂量依赖性,P 0.01;APS能显著提高胃癌大鼠血清IgA、IgG及IgM水平,且呈剂量依赖性,P 0.01;APS治疗后,胃癌大鼠CD4+和CD4+/CD8+较模型对照组明显上升,且呈剂量依赖性,P 0.01。APS各剂量组平均瘤重较模型对照组均明显降低,P 0.01~0.05;APS高剂量组抑瘤率明显高于低、中剂量组,P 0.01。与模型对照组相比,APS各剂量组胃癌组织中CD40蛋白表达均显著增加,PI3K蛋白表达降低,P 0.05。结论作为中药黄芪的天然提取物,APS的主要成分为葡聚糖。APS能显著提高胃癌大鼠的细胞和体液免疫功能,并抑制肿瘤生长。APS与CD40信号关系密切,表现为APS既能活化CD40信号,增强其所诱导的机体特异性抗胃癌效应;亦能阻断PI3K信号途径,抑制其相关的胃癌免疫编辑作用。APS较之于传统化疗药物,无明显毒副作用,且不易产生耐药性。因此,APS在胃癌免疫治疗领域具有良好的应用前景。


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