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抗血小板膜糖蛋白单抗片段肺栓塞动物模型显像研究

季顺东  
【摘要】:肺栓塞(pulmonary embolism, PE)是一种高发病率和具有潜在致死性的疾病,快速诊断和及时的治疗可以降低肺栓塞的致死率和致残率,同时避免不必要的溶栓治疗。虽然影像学检查方法已在动脉栓塞症[PE和深静脉血栓形成(deep venous thrombosis , DVT)]的诊断中发挥着至关重要的作用,但一直还缺乏一种单一的无创诊断方法,可以可靠地诊断动脉栓塞并识别血栓的病理状态(新鲜或陈旧血栓)。单光子发射计算机断层成像(single photon emission computed tomography ,SPECT)是一种高度敏感的成像技术,利用~(99m)锝( technetium,~(99m)Tc)标记的与血栓主要成份结合的血栓显像剂,进行SPECT显像诊断PE和DVT,可以为肺栓塞的诊断提供新的思路和办法。 本研究以鼠源性抗人血小板P选择素单抗SZ51-F(ab)_2以及人鼠嵌合抗血小板GPIIIa的单抗chSZ21-F(ab)_2 ,经~(99m)Tc标记后,进行犬肺栓塞动物模型显像研究,评估其作为血栓显像剂进行体内血栓显像的可行性。此外,还进行了原核表达抗P选择素多肽的初步尝试。 方法 制备了SZ51-F(ab)_2及chSZ21-F(ab)_2抗体片段,经流式细胞仪检测以及ADP诱导的血小板聚集实验证实了单抗片段与各自靶抗原结合的特异性和亲和力。选用比格犬制备了肺栓塞模型,通过导管将特制的双股螺旋金属丝送入比格犬肺动脉内制备肺栓塞模型,同法制备股静脉模型。金属丝放置30分钟后,X -射线造影证实血栓栓塞的存在及其位置。 以2-IT修饰抗体片段,以葡庚糖酸钠转换络合法进行~(99m)Tc标记,进行制备24h的PE以及DVT的显像。动物显像3小时后,进行肝素化处理,实施安乐死。迅速取出心肺,排空血液后,进行肺栓塞模型体外SPECT显像,判断放射性浓聚部位与栓塞部位是否一致。多点采集主要脏器的组织块,测量放射性计数后称重,计算组织分布,结果以注射剂量百分比( percentage injected dose per gram , %ID/g)形式表示。 此外,还通过基因克隆的方法,构建抗P选择素多肽P851及P851-GST融合蛋白表达载体,经IPTG诱导表达后,Westernblot法鉴定了表达的多肽与血小板膜裂解液的结合能力。 结果 流式细胞仪检测结果证实SZ51-F(ab)_2和chSZ21-F(ab)_2可与各自靶抗原特异性结合。chSZ21-F(ab)_2抑制ADP诱导的人和犬富血小板血浆聚集试验的半数有效剂量IC50分别为11.6±7.9 nM和24.9±18.8 nM。 ~(99m)Tc-SZ51-F(ab)_2显像结果表明SZ51-F(ab)_2与活化血小板表面P-选择素具有高亲和力结合,能够检测比格犬体内的形成24小时以上的肺栓塞,注射显像剂3小时内能够清晰显示肺栓塞。因此,~(99m)Tc-SZ51-F(ab)_2具有潜在的肺栓塞显像应用前景。 在比格犬血栓栓塞模型体内,注射~(99m)Tc-chSZ21-F(ab)_2后30min和60min出现DVT和PE部位的放射性浓聚,且随着时间的延长而增强。显像3小时后处死动物,离体检测结果表明,PE和DVT的注射剂量百分比(%ID/g)分别为0.076%和0.083%。体外检测结果表明:肺动脉血栓与正常肺组织的单位质量放射性比值平均为12.8±3.7,下肢深静脉血栓与血液的单位质量放射性比值平均为7.2±1.9,与肌肉的比值平均为117.0±5.3。 通过大肠杆菌表达系统,我们成功获得了具有人血小板P选择素结合活性的多肽,但表达量尚不理想,还有待进一步改进。 讨论 随着PE研究的进展,对可疑PE患者的诊断已变得更加安全、简便和快捷。虽然目前的CTPA和肺通气/灌注显像等检查方法已广泛应用于临床PE患者的诊断,但这些方法都是通过“阴性显像”进行诊断,仍存在无法鉴别新鲜和陈旧血栓的不足。SPECT成像和正电子发射断层成像(PET),可以实现分子水平的功能成像,从而为判断血栓的病理状态提供更多的信息。 通常认为,PE和DVT是同一种病理类型疾病的不同临床表现形式。因此通过一项检查实现同时无创诊断PE和DVT,可以为血栓栓塞性疾病的诊断提供新的思路和方法。开发可与血栓表面的血小板或纤维蛋白成分特异性结合的血栓显像剂,将有助于实现这一目标。 每个血小板表面约有80,000个糖蛋白GPIIb/IIIa受体表达,为血栓显像提供了一个高容量的血栓显像剂结合位点。理论上,无论是针对纤维蛋白还是血小板的血栓显像剂均可进行肺栓塞分子显像,但由于纤维蛋白在新鲜和陈旧血栓都有大量表达,所以应用针对血小板靶位点的分子探针鉴别新鲜和陈旧肺栓塞更有优势。另一方面,血小板聚集发生在血栓形成的早期阶段,此后随着纤维蛋白和大量红细胞包裹血栓,导致形成数日后的血栓表面,可供以血小板为靶点的血栓显像剂的结合位点减少,从而无法进行陈旧血栓显像。因此,理论上可以利用以血小板为靶点的血栓显像剂的这一特点,鉴别新鲜和陈旧血栓。 本研究的不足之处在于,~(99m)Tc-chSZ21-F(ab)_2在动物体内清除较慢,血液中的血池背景较高。在未来的研究中,制备分子量更小,体内代谢分布特性更好在的血栓显像剂将有助于改进这一不足。 结论 ~(99m)Tc-SZ51-F(ab)_2与活化血小板表面P-选择素具有高亲和力结合,能够检测比格犬体内的形成24小时以上的肺栓塞,注射显像剂3小时内能够清晰显示肺栓塞。因此,~(99m)Tc-SZ51-F(ab)_2具有潜在的肺栓塞显像应用前景。嵌合抗体片段chSZ21-F(ab)_2可与血小板表面糖蛋白IIb/ IIIa受体高特异性和高亲和力地结合,并经~(99m)Tc标记后,在实验犬血栓栓塞模型中显像成功。静脉注射~(99m)Tc-chSZ21-F(ab)_2 3小时后,可以在动物模型体内,清晰显示PE和DVT,具有成为可在一项检查中同时检出PE和DVT的血栓显像剂的潜力。


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