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P-糖蛋白对~(18)F-FDG、~(99m)Tc-MIBI摄取影响的实验研究

郁春景  
【摘要】:第一部分P-糖蛋白功能验证及与18F-FDG摄取相关蛋白检测 目的利用Western Blot法测定Bcap37/MDR1与Bcap37细胞中P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、葡萄糖转运蛋白1(Glucose transporter1,Glut-1)及己糖激酶-II(Hexokinase-II,HK-II)表达,利用罗丹明123荧光染色评价P-gp功能。方法提取Bcap37/MDR1及Bcap37细胞蛋白,采用Western Blot法测定细胞中P-gp、Glut-1及HK-II的表达情况,在有或无P-gp抑制剂维拉帕米(Verapamil,VER)存在的情况下,分别将Bcap37/MDR1与Bcap37细胞与罗丹明123共孵育60min,然后吸去上清液,再用冰冷的PBS液洗脱3次,用荧光显微镜观察细胞内罗丹明123荧光强度。 结果P-gp在Bcap37/MDR1细胞中有高水平表达,而Bcap37细胞几乎无P-gp表达;Bcap37/MDR1细胞有较高水平的Glut-1表达,而Bcap37细胞仅表现为非常弱的Glut-1的表达; HK-II在两种细胞中均有较高水平表达。Bcap37、Bcap37/MDR1细胞与罗丹明123共孵育,Bcap37细胞内有明显荧光染色,Bcap37/MDR1细胞内仅有弱的荧光染色。加入VER后,Bcap37/MDR1细胞内的荧光染色明显增强。VER对Bcap37细胞荧光染色无明显影响。 结论P-gp、Glut-1在Bcap37/MDR1细胞中的表达明显强于Bcap37细胞;Bcap37/MDR1所表达的P-gp具有相应的外排功能,该细胞能够用来评价P-gp与18F-FDG、99mTc-MIBI摄取之间的关系。 第二部分99mTc-MIBI在Bcap37、Bcap37/MDR1细胞中的聚集实验 目的通过99mTc-MIBI细胞内摄取动力学研究99mTc-MIBI能否评价Bcap37/MDR1细胞P-gp功能及在评价P-gp抑制剂抑制效能中的作用。方法培养Bcap37及Bcap37/MDR1细胞,将Bcap37及Bcap37/MDR1细胞接种于6孔细胞培养板上,接种密度为1×106细胞/孔,将99mTc-MIBI、VER及GF120918用不含胎牛血清的RPMI1640培养基分别配成74KBq/mL99mTc-MIBI溶液、74KBq/mL99mTc-MIBI+100μmol/L VER溶液及74KBq/mL的99mTc-MIBI+50μmol/L GF120918溶液。用上述配制好的溶液孵育Bcap37及Bcap37/MDR1细胞,分别于10min、30min、60min及120min吸取孵育液,置于试管内,用冰冷的PBS液洗脱3次,洗脱液一并放置相应的试管内。然后采用胰酶消化细胞,消化完成后吸出细胞置于试管内,再分别用1mL PBS液洗脱3次,洗脱液置于放置细胞的试管内,采用γ计数仪测量各个试管内的放射性计数,计算Bcap37、Bap37/MDR1细胞中99mTc-MIBI的摄取率。摄取率=细胞内放射性计数/(细胞内放射性计数+上清液放射性计数)×100%,实验重复三次。计算结果用x±s表示,两种细胞间及同种细胞不同处理组间99mTc-MIBI摄取率比较行配对t检验。 结果Bcap37细胞在有或无抑制剂存在的情况下,99mTc-MIBI摄取率之间无统计学差异;Bcap37/MDR1细胞在有抑制剂存在的情况下99mTc-MIBI摄取率在孵育30min、60min及120min要明显高于无抑制剂存在时的摄取率(P0.05);在无抑制剂存在的情况下,Bcap37细胞99mTc-MIBI摄取率在孵育30min、60min及120min要明显高于Bcap37/MDR1细胞(P0.05);在有抑制剂存在的情况下,Bcap37/MDR1细胞的99mTc-MIBI摄取率略低于Bcap37细胞,但两者无统计学差异。 结论99mTc-MIBI在Bcap37细胞与Bcap37/MDR1细胞中的摄取率有显著差异,P-gp抑制剂能够增加Bcap37/MDR1细胞的99mTc-MIBI摄取率,表明可以用99mTc-MIBI摄取动力学变化评价P-gp的功能;同时多药耐药细胞系99mTc-MIBI摄取率的变化能够用于评价P-gp抑制剂的抑制效率。 第三部分18F-FDG在Bcap37、Bcap37/MDR1细胞中的聚集实验 目的测定18F-FDG在Bcap37与Bcap37/MDR1细胞的摄取动力学变化,评价P-gp抑制剂存在时Bcap37与Bcap37/MDR1细胞对18F-FDG摄取的变化,在细胞水平上探讨18F-FDG摄取与P-gp表达之间的关系。方法将Bcap37及Bcap37/MDR1细胞分别接种于6孔细胞培养板上,细胞密度为1×106细胞/孔,将18F-FDG、VER及GF120918用不含胎牛血清的RPMI1640培养基分别配成37KBq/mL18F-FDG溶液、37KBq/mL18F-FDG+100μmol/L VER溶液及37KBq/mL的18F-FDG+50μmol/L GF120918溶液。分别用上述配制好的溶液孵育Bcap37及Bcap37/MDR1细胞,分别于10min、30min、60min及120min吸取孵育液置于试管内,再用冰冷的PBS液洗脱3次,洗脱液一并放置相应的试管内。细胞用胰酶消化,消化完成后吸出细胞置于试管内,用1mL PBS液洗脱3次,洗脱液置于放置细胞的试管内,用γ计数仪测量各个试管内的放射性计数,计算Bcap37、Bap37/MDR1细胞的18F-FDG摄取率,摄取率=细胞内放射性计数/(细胞内放射性计数+上清液放射性计数)×100%,实验重复三次。计算结果用x±s表示,两种细胞间及同种细胞不同处理组间18F-FDG摄取率比较行配对t检验。 结果无抑制剂存在的情况下,孵育10min时Bcap37/MDR1细胞中18F-FDG摄取率显著高于Bcap37细胞,其摄取率分别为1.88%±0.19%和1.37%±0.18%(P0.05);孵育60min和120min时Bcap37细胞中18F-FDG摄取率显著高于Bcap37/MDR1细胞,其摄取率分别为2.29%±0.23%、2.34%±0.15%和1.47%±0.14%、1.53%±0.22%(P0.05)。VER或GF120918共孵育后,Bcap37/MDR1细胞在60min和120min时18F-FDG摄取率分别为2.45%±0.21%、2.46%±0.25%和2.50%±0.24%、2.48%±0.27%,较无抑制剂存在时明显增加(P0.05)。Bcap37细胞在有无抑制剂存在的情况下,18F-FDG摄取率无明显变化,差异无统计学意义。 结论细胞实验结果表明18F-FDG是P-gp的底物之一,Bcap37/MDR1细胞与Bcap37细胞间18F-FDG摄取率的差异是由于P-gp所介导的外排引起的,可以用18F-FDG动力学变化评价肿瘤细胞的P-gp功能,细胞内试验结果显示18F-FDG有可能作为活体内无创性评价肿瘤细胞的P-gp功能的显像剂。 第四部分99mTc-MIBI在Bcap37、Bcap37/MDR1荷瘤小鼠显像研究 目的利用荷Bcap37/MDR1与Bcap37细胞的BALB/c裸鼠模型,研究99mTc-MIBI在荷瘤小鼠体内显像,探讨99mTc-MIBI显像可否用于活体内评价肿瘤细胞的多药耐药。方法取处于对数生长期的Bcap37及Bcap37/MDR1细胞,用无血清的RPMI1640培养基制成细胞悬液,细胞计数后用无血清的RPMI1640培养基将细胞浓度稀释为1×10~7/mL,按0.2mL/只接种于4~6周龄的BALB/c裸鼠右侧腋窝皮下,5只裸鼠接种Bcap37细胞,5只裸鼠接种Bcap37/MDR1细胞。待肿瘤长至直径1.0~1.5cm时进行99mTc-MIBI SPECT显像。将荷Bcap37细胞裸鼠及荷Bcap37/MDR1细胞裸鼠通过尾静脉给予37MBq(1mCi,0.2mL)配制好的99mTc-MIBI,分别于给药后10min及60min行平面静态显像,隔日在相同采集条件下,尾静脉给予37MBq(1mCi,0.2mL)配制好的含有0.5mg/Kg VER的99mTc-MIBI溶液,分别于给药后10min及60min行平面静态显像。显像结束后,处死荷瘤小鼠后迅速取出肿瘤组织及肝脏组织,制成电镜标本,观察荷瘤小鼠肿瘤组织及肝脏组织线粒体情况。 结果99mTc-MIBI生理性摄取可见于肝脏、肠道、肾脏及膀胱,部分荷瘤小鼠尾静脉注射部位可见轻度显影。荷Bcap37或Bcap37/MDR1肿瘤细胞裸鼠肿瘤部位在给予99mTc-MIBI后10min未见明显显影,60min后肿瘤部位同样未见明显显影。荷Bcap37或Bcap37/MDR1肿瘤细胞裸鼠在给予含0.5mg/Kg VER的99mTc-MIBI后10min及60min肿瘤部位均未见明显显影。荷Bcap37及Bcap37/MDR1肿瘤细胞裸鼠肿瘤组织细胞内线粒体数量较少,肝脏组织细胞内存在较多的线粒体,且线粒体体积明显大于肿瘤细胞内线粒体。 结论荷Bcap37与Bcap37/MDR1肿瘤细胞裸鼠肿瘤组织99mTc-MIBI未见显影,同时给予P-gp抑制剂后肿瘤组织仍未见显影,表明选用荷瘤小鼠行99mTc-MIBI显像评价P-gp功能时要筛选肿瘤细胞株,应挑选99mTc-MIBI摄取率高且肿瘤细胞内线粒体较丰富的细胞株。 第五部分18F-FDG在Bcap37、Bcap37/MDR1荷瘤小鼠显像研究 目的研究荷Bcap37/MDR1及Bcap37肿瘤细胞荷瘤小鼠在有/无VER存在情况下肿瘤组织的18F-FDG摄取,在活体内评价P-gp与18F-FDG摄取的关系。方法荷瘤小鼠禁食6h,将需要动态采集的荷瘤小鼠置于小动物PET床板上,异氟烷吸入麻醉,胶带固定,身体置于视野中心,维持异氟烷麻醉浓度为2%。床前经尾静脉给予7.4MBq(0.2mCi,0.2mL)18F-FDG,给药后立即采集,共采集90min,得到各个时间段的动态显像图像,绘制感兴趣区(region of interest, ROI)的时间放射性曲线(time activity curve,TAC)。比较荷Bcap37肿瘤细胞裸鼠与荷Bcap37/MDR1肿瘤细胞裸鼠肿瘤组织18F-FDG摄取的TAC曲线。相同采集及处理方法,尾静脉给予含有0.5mg/Kg VER的7.4MBq(0.2mCi,0.2mL)18F-FDG,获得VER治疗后肿瘤组织18F-FDG摄取的TAC曲线。观察VER治疗后其18F-FDG TAC曲线,并与未行VER治疗时进行比较。另取10只荷瘤小鼠(5只荷Bcap37肿瘤细胞,5只荷Bcap37/MDR1肿瘤细胞),采用静态采集方法行18F-FDG Micro PET显像。荷瘤小鼠禁食6h,吸入异氟烷预麻醉,尾静脉给予7.4MBq(0.2mCi,0.2mL)18F-FDG,60min后行静态采集。在相同的采集处理条件下,尾静脉给予含有0.5mg/Kg VER的7.4MBq(0.2mCi,0.2mL)18F-FDG,获得VER治疗后肿瘤组织18F-FDG的静态图像,计算肿瘤组织的SUVmean。比较VER治疗前后肿瘤组织18F-FDG SUVmean的变化。显像结束后,处死荷瘤小鼠后将肿瘤组织制成蜡块,肿瘤标本行P-gp、Glut-1及HK-II免疫组化染色。 结果18F-FDG Micro-PET动态显像显示Bcap37肿瘤组织18F-FDG摄取渐进性增高,在10~15min内达峰值水平,然后维持在平台水平;Bcap37/MDR1肿瘤组织18F-FDG摄取同样渐进性增高,在大约9min时达到峰值,然后18F-FDG摄取渐进性下降,在25~30min时达到平台,然后维持在平台水平。Bcap37/MDR1肿瘤组织18F-FDG摄取在0~9min要高于Bcap37肿瘤组织,9min后Bcap37肿瘤组织18F-FDG摄取水平要高于Bcap37/MDR1肿瘤组织。有或无VER存在情况下Bcap37肿瘤组织18F-FDG摄取动态曲线无明显差异;Bcap37/MDR1肿瘤组织在有或无VER存在的情况下,其0~15min18F-FDG摄取动态曲线无明显差异,但在15min下降到最低点后,18F-FDG摄取开始渐进性升高,约30min达到最高水平,然后维持在平台水平。VER显著增加Bcap37/MDR1肿瘤组织平台期18F-FDG摄取水平。荷瘤小鼠静态Micro PET显像,在无VER存在情况下Bcap37肿瘤组织SUVmean要显著高于Bcap37/MDR1肿瘤组织(1.00±0.06、0.66±0.11,P0.05);Bcap37肿瘤组织18F-FDG摄取水平在有或无VER存在情况下无明显差异(1.00±0.06、1.09±0.22,P0.05);Bcap37/MDR1肿瘤组织在VER存在情况下,18F-FDG摄取水平要明显高于无VER存在时(1.01±0.16、0.66±0.11,P0.05)。Bcap37/MDR1肿瘤标本细胞膜P-gp免疫组化强染色,Bcap37肿瘤组织细胞膜几乎无P-gp免疫组化染色;Bcap37/MDR1肿瘤组织细胞膜可见Glut-1免疫组化强染色,Bcap37肿瘤组织细胞膜仅有轻度Glut-1免疫组化染色;Bcap37/MDR1与Bcap37肿瘤组织细胞浆内见轻-中度HK-II免疫组化染色。结论动物实验与细胞实验结果相吻合,提示18F-FDG是P-gp的底物。18F-FDG结合VER可能是一种有效、无创检测肿瘤多药耐药的方法。荷Bcap37/MDR1肿瘤细胞裸鼠肿瘤组织18F-FDG在有/无VER存在时呈特征性改变,提示18F-FDG PET或PET/CTList Mode采集在探测肿瘤多药耐药方面可能具有潜在的临床应用价值。


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