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椎体成形术骨水泥渗漏对椎间盘退变的影响及作用机制的实验研究

毛海青  
【摘要】:目的:探讨骨水泥颗粒对人髓核细胞生物学行为的影响。方法:用不同浓度的磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)颗粒和两种聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥(polymethylmethacrylate,PMMA)颗粒(PMMA1直径1-10μm和PMMA2直径0.3-0.4μm)处理人髓核细胞(human nucleus pulposus cells,HNPCs),观察在不同时间点骨水泥颗粒对HNPC细胞活性、细胞周期、凋亡和衰老的影响。结果:CPC颗粒处理对HNPC生物学行为无显著影响,PMMA颗粒在低浓度0.001,0.01%v/v时对HNPC细胞活性未产生显著影响,当浓度达到0.1%v/v以上时,能明显抑制髓核细胞的增殖活性(P0.05)。PMMA1颗粒处理3.0d和6.0d,PMMA2颗粒处理6.0d时,骨水泥颗粒对HNPC细胞增殖的抑制效应随颗粒浓度的增加而逐渐增强;当PMMA1颗粒浓度为0.1、0.5和1.0%v/v时,PMMA2颗粒浓度为1.0%v/v时,PMMA颗粒对HNPC细胞的抑制增殖效果随着时间的延长逐渐加强(P0.01)。当浓度0.5和1.0%v/v时,PMMA1颗粒比PMMA2颗粒对HNPC细胞活性有更强的抑制作用(P0.05)。当浓度为0.01%v/v以上,PMMA颗粒作用导致HNPC G0/G1期细胞数量明显增加(P0.05)。PMMA1颗粒处理1.0、3.0和6.0d,PMMA2颗粒处理6.0d时,在同一时间点HNPC G0/G1期细胞的比例随颗粒浓度的增加而逐渐增高;当PMMA颗粒浓度为0.5和1.0%v/v时,PMMA颗粒对HNPC细胞G0/G1期阻滞率随时间的延长而增高(P0.01)。与空白对照组相比,0.5和1.0%v/v PMMA1颗粒处理6.0d后HNPC细胞中坏死细胞和凋亡细胞的比例明显增高(P0.01),细胞衰老β-半乳糖苷酶染色阳性的细胞数量明显增加(P0.01),Western-blot结果显示HNPC细胞内p16INK4A表达显著增高。结论:CPC颗粒在体外对髓核细胞活性和细胞周期没有显著影响,而一定浓度的PMMA颗粒作用一定时间后,对髓核细胞活性和细胞周期产生显著影响,导致细胞数量减少,细胞被阻滞于G0/G1期,并且该效应具有时间依赖性和剂量依赖性。PMMA1颗粒比PMMA2颗粒对髓核细胞活性有更强的抑制作用。进一步研究表明,PMMA1颗粒能够促进髓核细胞的坏死和凋亡,诱导髓核细胞衰老。 目的:探讨骨水泥颗粒处理后人髓核细胞基因表达变化。方法:用浓度为1%v/v的CPC和PMMA骨水泥颗粒处理HNPC,在不同时间点用实时荧光定量PCR检测HNPC中细胞外基质(extracellular matrix,ECM)结构相关基因、促进ECM合成代谢基因和促进ECM分解代谢基因的表达水平。结果:CPC颗粒可以上调aggrecan(ACAN)、Ⅰ型胶原(COL1A1)和Ⅱ型胶原(COL2A1)的表达,分别为作用前的3.2倍、2.05倍和2.56倍;PMMA颗粒能上调Ⅰ型胶原(COL1A1)和Ⅱ型胶原(COL2A1)的表达,分别为作用前的3.15倍和3.71倍,但对aggrecan(ACAN)的表达无显著影响。CPC颗粒能够上调HNPC中编码骨形态发生蛋白基因(BMP2和BMP7)的表达(分别比作用前增加3.17倍和2.39倍),也能够增加转录因子SOX9基因的表达(2.81倍)和金属蛋白酶组织抑制物(TIMP1和TIMP2)基因的表达(分别为2.47和3.38倍);PMMA颗粒作用后HNPC中BMP2、BMP7和SOX9基因表达均没有明显增加,但TIMP1和TIMP2表达上调(分别增加3.33和3.36倍)。CPC和PMMA骨水泥颗粒均可以使HNPC中基质金属蛋白酶3、7、9和13基因(MMP3、MMP7、MMP9和MMP13)的表达上调。其中,CPC颗粒处理后四种基质金属蛋白酶基因的表达分别比作用前增加3.8、2.68、3.39和3.15倍;PMMA颗粒处理后分别增加2.9、3.81、2.97和3.81倍。CPC颗粒使IL1A、IL1B和TNF基因表达分别增加2.97、4.44和2.8倍,PMMA颗粒使IL1B和TNF基因表达分别增加2.18和3.08倍。大部分基因表达高峰出现在骨水泥颗粒处理后1.0d和3.0d,但CPC颗粒处理的SOX9、TIMP1和TNF基因表达的高峰出现在处理后6.0d。结论:骨水泥颗粒对髓核细胞ECM结构相关基因的表达和ECM代谢相关基因的表达均产生显著的影响,PMMA颗粒可能比CPC颗粒具有更强的促进ECM分解代谢的作用。骨水泥颗粒处理使ECM相关基因的表达出现非同步改变,可能导致原有的ECM代谢的动态平衡难以维持。 目的:探讨骨水泥颗粒注射诱导兔腰椎间盘退变的速度、程度和免疫组化改变。方法:选用60只新西兰大白兔,随机分成空白对照组、退变对照组、假手术组、PMMA组和CPC组。退变对照组用16G穿刺纤维环,假手术组用26G针穿刺,PMMA组和CPC组分别用浓度为1%v/v的CPC和PMMA颗粒混悬液通过26G针注入兔腰椎间盘。对不同时间点的动物进行影像学检查,组织学检查,免疫组化分析和TUNEL法检测凋亡细胞。结果:X线检查结果显示,PMMA组术后3周椎间隙较术前明显狭窄(P0.01),并持续加重至术后12周(P0.01),椎间盘高度下降的程度在术后各时间点均高于假手术组(P0.01),但低于退变对照组(P0.01)。CPC组与假手术组对比无显著差异(P0.05)。MRI检查结果显示各组间Thompson评分存在显著差异(P0.01)。术后6周和12周时PMMA组评分高于假手术组(P0.005)。CPC组评分与假手术组没有显著差异,PMMA组和退变对照组没有显著差异。组织学评分结果显示,各组间组织学评分存在显著差异(P0.01)。在术后各时间点,空白对照组与退变对照组组织学评分具有显著差异,PMMA组退变程度高于假手术组和CPC组,CPC组退变程度低于退变对照组(P0.005)。PMMA组与退变对照组比较无显著差异,CPC组与假手术组比较无显著差异。II型胶原免疫组化检测发现,空白对照组、假手术组和CPC组髓核组织ECM呈强阳性染色,平均光密度值与退变对照组、PMMA组在不同时间点均有显著差异(P0.05)。MMP7免疫组化结果发现,空白对照组、假手术组和CPC组的标本MMP7免疫阳性细胞数量较低,与退变对照组和PMMA组标本在各时间点阳性细胞率有显著差异(P0.05)。退变对照组和PMMA组术后3周和6周的阳性细胞率的逐渐增高,至12周时阳性细胞的比例明显下降(P0.05)。TUNEL法检测凋亡细胞结果示退变对照组和PMMA组在各时间点的细胞凋亡率与空白对照组,假手术组和CPC组均有显著差异(P0.01)。退变对照组和PMMA组在均在6周时凋亡率达到顶峰,至12周时明显减少(P0.05)。结论:PMMA颗粒注射使髓核内Ⅱ型胶原合成减少,MMP7表达增加,并且能够诱导髓核细胞凋亡,从而引起椎间盘退变。影像学表现为椎间隙高度降低,椎间盘磁共振信号改变。PMMA颗粒引起的椎间盘退变与经典的椎间盘退变模型相比速度较慢、程度较轻,同样浓度和剂量的CPC颗粒注射对椎间盘退变的影响不显著。


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