神经干细胞和嗅粘膜嗅鞘细胞共培养及移植治疗切割海马伞大鼠的研究

【摘要】：目的：比较大鼠嗅粘膜（Olfactory Mucosa，OM）和嗅球（Olfactory Bulb，OB）嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells，OECs）在体外分离培养中增殖和分化以及生物学特性的差异；研究嗅粘膜OECs和神经干细胞（Neural stem cells, NSCs）直接接触和非直接接触共培养对NSCs增殖和分化的影响；将嗅粘膜OECs和NSCs移植到切割海马伞大鼠脑中，观察大鼠行为改善以及NSCs的存活和分化情况。为应用嗅鞘细胞和神经干细胞治疗神经系统疾病奠定理论基础。 方法： （1）分别取SD大鼠嗅粘膜（OM）和嗅球（OB）用差速贴壁法在体外分离培养嗅鞘细胞（OECs），在倒置显微镜下观察并拍摄嗅鞘细胞的生长情况； （2）用扫描电镜观察嗅粘膜及嗅球OECs的形态； （3）用Elisa法检测嗅粘膜及嗅球OECs培养液上清中NGF和BDNF的含量； （4）用p75NGFR和S-100免疫荧光抗体双标记检测嗅粘膜及嗅球OECs体外增殖和分化情况。 （5）用体外分离培养获得的嗅粘膜OECs和NSCs，直接接触组用24孔培养板、非直接接触组用高通量24孔Transwell培养板共培养OECs和NSCs，单纯NSCs组作为对照组，比较各组NSCs分化为神经元的情况。 （6）用体外分离培养的大鼠嗅粘膜OECs和NSCs，将单纯NSCs、Transwell组下层的NSCs、直接接触组OECs和NSCs移植到切割双侧海马伞的SD大鼠双侧海马齿状回中，对照组注射生理盐水。移植后2W、4W、6W和8W行避暗回避试验和跳台试验。然后灌注、取脑和冰冻切片，用BrdU和MAP-2免疫荧光抗体双标记检测移植的NSCs存活和分化情况。 结果： （1）嗅粘膜OECs与嗅球OECs在原代培养各时期OECs球的形成、数量和大小无明显差异； （2）扫描电镜显示：嗅粘膜OECs以双极样细胞为主；嗅球OECs的形态有3种：双极样细胞、三极样细胞和扁圆形细胞,其中以对称突起的双极样细胞为主。 （3）ELISA测定结果显示：两种OECs上清液中均含有NGF和BDNF，含量随着培养时间的延长而逐渐升高；而培养各相同时期的嗅粘膜OECs分泌的NGF和BDNF浓度与嗅球OECs相比无统计学差异。 （4）p75NGFR和S-100免疫荧光双标结果显示：嗅粘膜（OM）和嗅球（OB）组S-100和p75NGFR双标阳性细胞数量均较多，嗅粘膜嗅鞘细胞以双极样细胞为主，其胞体多为细长的梭形，突起细长。嗅球嗅鞘细胞的形态多样，有双极样细胞、三极样细胞和扁圆形细胞，胞体呈长梭形、三角形或圆形。两组OECs的纯化率、胞体面积和细胞周长这三项指标均没有显著性差异。 （5）直接接触组和Transwell组MAP-2阳性细胞细胞数量多，较大，突起长而且分枝丰富；直接接触组阳性细胞胞体胞体要明显大于其他两组。直接接触组和Transwell组的MAP-2阳性细胞比例、细胞周长均大于对照组，而直接接触组和Transwell组相比，直接接触组的MAP-阳性细胞周长大于Transwell组，但两组MAP-2阳性细胞比例无明显差异。 （6）细胞移植术后行为学检测结果：直接接触组和其他3组大鼠避暗回避试验探索次数和滞留时间相比差异有显著性。移植后6W和8W直接接触组和NSCs组、Transwell组避暗回避试验探索次数比较差异有显著性。3组细胞移植组和对照组大鼠跳台实验的主动及总回避阳性率比较差异有显著性，直接接触组细胞移植术后大鼠的跳台实验主动回避率明显高于NSCs组和Transwell组。两两比较结果：直接接触组分别和NSCs组、Transwell组比较差异有显著性。三组移植细胞进行MAP-2和BrdU免疫荧光检测结果显示：三组移植区脑组织切片中均有MAP-2和BrdU双标阳性细胞，直接接触组和Transwell组中的双标阳性细胞明显多于单纯NSCs组，直接接触组双标阳性细胞的胞体明显大于Transwell组和NSCs组。 结论： （1）嗅粘膜OECs与嗅球OECs一样能在体外分离培养和增殖。嗅粘膜OECs以双极样细胞为主，而嗅球OECs的形态多样，有双极样细胞、三极样细胞和扁圆形细胞。嗅粘膜OECs与嗅球OECs均能分泌NGF和BDNF。嗅粘膜OECs与嗅球OECs分化成熟后的形态无明显差异。 （2）OECs与NSCs直接接触和非直接接触共培养均能明显提高NSCs向神经元分化的比例。OECs与NSCs直接接触共培养，更能促进神经元的生长和成熟。 （3）NSCs组、Transwell组和直接接触组细胞移植入切割海马伞大鼠海马后，能改善模型鼠的认知行为。OECs和NSCs直接接触更能促进NSCs在体内的存活，并向神经元分化。