收藏本站
收藏 | 论文排版

转染LMP-1基因人脂肪间充质干细胞与退变髓核细胞体外双层细胞微球三维条件下共培养的实验研究

李雪峰  
【摘要】:目的:探讨人退变髓核细胞的体外分离、培养扩增及鉴定方法,并观察细胞微球三维培养对其生物学特性的影响。方法:收集25例人退变椎间盘手术髓核标本组织,体外采用0.025%的Ⅱ型胶原酶消化法将原代髓核细胞分离并连续培养扩增传代。利用倒置相差显微镜观察髓核细胞形态变化,通过Ⅱ型胶原及aggrecan免疫荧光化学染色法鉴定髓核细胞类软骨表型分子的表达。分别采用常规单层培养和细胞微球三维培养退变髓核细胞,共设3个观察时间点(7、14、21天)。通过RT-PCR方法检测两组细胞aggrecan、Ⅱ型胶原及SOX-9等基因的表达变化。结果:应用0.025%的Ⅱ型胶原酶37℃消化4小时即可分离出一定数量的原代人退变髓核细胞;体外培养观察发现其平均8天贴壁,细胞呈梭形、类圆形或多角性,细胞达到80%融合平均约需4周。免疫荧光化学及甲苯胺蓝染色法检测发现分离培养的髓核细胞可表达Ⅱ型胶原及aggrecan蛋白。RT-PCR检测结果显示细胞微球三维培养组髓核细胞aggrecan、Ⅱ型胶原蛋白及SOX-9基因的表达显著高于单层培养组(P0.05)。结论:采用0.025%的Ⅱ型胶原酶消化法可从退变椎间盘手术标本中分离出一定数量退变髓核细胞。该细胞呈类软骨表型(表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原)。与常规单层培养相比,细胞微球三维培养可较好地保持其类软骨表型。 目的:体外分离、培养扩增人脂肪组织来源的间充质干细胞,并通过流式细胞仪及多向诱导分化对其干细胞特性进行鉴定。方法:取10例剖腹产手术皮下脂肪标本,采用0.075%的Ⅰ型胶原酶消化法结合反复贴壁法分离培养并纯化人脂肪间充质干细胞;倒置显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪检测干细胞表型分子。随后分别在单层和细胞微球三维环境下诱导人脂肪间充质干细胞定向成脂、成骨及成软骨分化,并采用油红O染色、Alizareen染色、Safranin’O染色、甲苯胺蓝染色、aggrecan及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色法检测。此外,应用RT-PCR方法检测单层诱导和细胞微球三维诱导环境下,人脂肪干细胞成软骨分化后的基因表达。结果:应用0.075%的Ⅰ型胶原酶37℃消化约1小时即可分离出较多的人脂肪间充质干细胞。原代人脂肪干细胞平均3天贴壁,达到80%融合约需9天;传至3代后,转变成均一的长梭形,并呈漩涡状排列。流式细胞仪检测分析发现人脂肪间充质干细胞高表达CD29、CD90、CD105分子,低表达CD34、CD45分子及HLA-DR。单层环境下多向诱导21天后,油红O染色、Alizareen染色、Safranin’O染色均呈阳性。细胞微球三维环境下成软骨诱导21天后,细胞团呈明显的软骨样形态,切片HE染色可见清晰的软骨特征样的细胞和细胞外基质分层排列。甲苯胺蓝、Masson三色染色、及II型胶原、aggrecan免疫组化染色均呈阳性。RT-PCR结果显示细胞微球三维环境下诱导的人脂肪干细胞软骨样表型基因(aggrecan、Ⅱ型胶原及SOX-9)高于单层诱导组(P0.05)。结论:通过Ⅰ型胶原酶消化结合反复贴壁法可获得大量纯化的人脂肪间充质干细胞,该细胞体外具有多向分化潜能,并且细胞微球三维诱导环境更适合其成软骨分化。 目的:构建携带人LMP-1基因的慢病毒载体并对其进行鉴定,以获得高滴度的携带LMP-1基因慢病毒载体用于脂肪干细胞的转染。观察LMP-1基因对细胞微球三维诱导环境下人脂肪间充质干细胞成软骨分化效应的影响。方法:根据人LMP-1基因(GeneBank序号:NM_005451)mRNA,设计并合成全基因的引物。从购买的cDNA文库中,利用PCR方法钓取目的基因。将目的基因与酶切线性化的载体进行定向交换,其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的目的质粒。最后将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提得到较高滴度、可表达LMP-1-GFP基因及GFP基因的慢病毒载体。并分别用于转染脂肪干细胞得到表达LMP-1-GFP基因或GFP基因的人脂肪干细胞。将转染LMP-1-GFP基因和GFP基因的人脂肪干细胞分别置于细胞微球三维环境中进行成软骨诱导分化。其中,转染LMP-1-GFP基因的脂肪干细胞分别采用含TGF-β3的成软骨诱导基和不含TGF-β3的成软骨基础诱导基进行成软骨诱导,同时用含TGF-β3的软骨诱导基对单纯表达GFP基因的脂肪干细胞进行成软骨诱导并设为对照组。诱导21天后,采用RT-PCR方法检测各组诱导细胞软骨表型基因的表达,观察LMP-1基因能否诱导细胞微球三维环境下人脂肪干细胞成软骨分化及其与TGF-β3诱导效应之间是否存在差异。结果:通过上述方法获得了高滴度(2x109TU/ml)的携带LMP-1基因的慢病毒。成软骨诱导对比实验表明TGF-β3诱导的转染LMP-1基因的人脂肪干细胞成软骨分化效应最强,其次为采用不含TGF-β3的成软骨基础诱导基诱导的转染LMP-1基因的脂肪干细胞,而采用含TGF-β3的成软骨诱导基诱导的转染GFP基因的人脂肪干细胞分化效应相对较弱,各组间差异有统计学意义(P0.05)。结论:慢病毒是一种良好的基因转导载体工具,可有效地转染人脂肪干细胞并获得相关基因大量表达。与BMP-2、-7成软骨效应类似,LMP-1基因也可诱导细胞微球三维诱导环境下人脂肪干细胞成软骨分化,并且该效应高于传统的诱导因子TGF-β3。此外,两者之间存在协同效应。 目的:观察并检测LMP-1基因对人脂肪间充质干细胞与退变髓核细胞在双层微球微球共培养环境下相互效应的影响,并分析相关机制。方法:采用携带LMP-1-GFP或GFP基因的慢病毒载体转染人脂肪间充质干细胞,获得表达LMP-1-GFP或GFP基因的人脂肪干细胞。将其与退变髓核细胞在双层细胞微球三维环境下共培养,同时设立混合细胞微球三维共培养及单独细胞微球三维培养组作为对照。共设立7个细胞培养组,分别为转染GFP基因脂肪干细胞三维细胞微球单独培养组,转染GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞混合细胞微球三维共培养组、转染GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞双层细胞微球三维共培养组、转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞三维细胞微球单独培养组、转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞混合细胞微球三维共培养组、转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞与退变髓核细胞双层细胞微球三维共培养组及髓核细胞三维细胞微球单独培养组。设立3个观察时间点:7、14、21天,采用阿利新蓝法检测各自蛋白聚糖含量,并通过流式细胞分选方法将表达GFP基因的脂肪干细胞与GFP表达阴性髓核细胞分离开来,采用RT-PCR方法检测共培养脂肪干细胞和退变髓核细胞各自aggrecan、Ⅰ、Ⅱ型胶原及SOX-9基因表达变化,并与单独培养组相比较。此外,我们还采用Western-blot蛋白免疫电泳法对各培养组脂肪干细胞上述基因变化在蛋白水平的表达进行了检测。结果:自培养的第14天起,双层细胞微球三维共培养组蛋白多糖合成高于其余各细胞培养组(P0.05),此外,转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞与髓核细胞共培养组蛋白多糖合成量显著高于转染GFP基因脂肪干细胞与髓核细胞共培养组(P0.05)。RT-PCR检测显示,自培养第7天起,细胞微球三维共培养组髓核细胞Ⅱ型胶原、SOX-9及Aggrecan等基因表达均高于单独髓核细胞三维微球培养组(P0.05)。但双层细胞微球三维共培养组髓核细胞上述基因表达与混合细胞微球三维共培养组髓核细胞表达无显著性差异(P0.05)。此外,与转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞共培养髓核细胞Ⅱ型胶原、SOX-9及Aggrecan基因表达高于与转染GFP基因脂肪干细胞共培养髓核细胞(P0.05)。此外,所有细胞微球三维培养组髓核细胞Ⅰ型胶原基因表达均随时间增长逐渐降低(P0.05)。除I型胶原外,脂肪干细胞三维细胞微球单独培养组未见上述基因表达。双层细胞微球三维共培养组脂肪干细胞上述基因表达高于混合细胞微球三维共培养组(P0.05)。此外,转染LMP-1-GFP基因脂肪干细胞上述基因表达高于转染GFP基因脂肪干细胞(P0.05)。三维细胞微球单独培养组脂肪干细胞Ⅰ型胶原基因表达逐渐增高,但细胞微球三维共培养组脂肪干细胞Ⅰ型胶原基因表达呈逐渐下降趋势,差异有统计学意义(P0.05)。此外,除I型胶原外,双层细胞微球三维共培养组转染GFP基因脂肪干细胞上述基因表达高于混合细胞微球三维共培养组转染LMP-1基因脂肪干细胞(P0.05)。结论:双层细胞微球三维共培养较混合细胞微球三维共培养更有利于髓核细胞对脂肪干细胞的类软骨诱导效应,同时,LMP-1基因可增强此效应,但双层共培养方式占主导作用。此外,脂肪干细胞对髓核细胞具有一定的营养效应,LMP-1基因也可增强此效应,而细胞微球三维共培养方式(双层或混合)对该效应无明显影响(P0.05)。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 邱匀峰;吴小涛;赵梓汝;王运涛;;骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养的实验研究[J];东南大学学报(医学版);2007年04期
2 李佩玲;时小丁;庄如锦;刘倩;;人脐带血来源的间充质干细胞特性及对卵巢癌细胞趋化作用的研究[J];中国优生与遗传杂志;2011年01期
3 郭嘉宁;雷建园;李奕;畅继武;;体外诱导胎儿骨髓间充质干细胞向胰岛β样分泌细胞的分化[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年19期
4 刘恺鸣;迟路湘;鲁向辉;;缺氧条件下大鼠脑微血管内皮细胞对共培养的人间充质干细胞分化的影响[J];第三军医大学学报;2008年07期
5 苏立,陈运贞,张晓刚,佘强;在心肌细胞/MSCs共培养体系中MSCs出现心肌分化表型[J];重庆医科大学学报;2005年05期
6 徐远;俞兴;徐林;;骨髓间充质干细胞与髓核细胞的体外共培养[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年27期
7 李全修;陈伯华;刘勇;徐陵;;构建兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年45期
8 刘煜婷;白全宏;;运用生物工程机理分析B MMS Cs移植技术[J];黑龙江科技信息;2009年28期
9 朱伟荣;李春海;叶伟;;间充质干细胞治疗椎间盘退变性疾病的研究进展[J];中国骨科临床与基础研究杂志;2010年01期
10 王爱红;何红燕;罗敏洁;黄天华;马廉;马桂霞;林丽敏;林广裕;史雪川;;人脐带间充质干细胞向胰岛样细胞的分化[J];中国组织工程研究与临床康复;2008年21期
11 赵庆华;田纪伟;;椎间盘再生基于细胞的治疗策略[J];中国矫形外科杂志;2011年05期
12 曾宪升;于宝丹;任敦强;王君丽;何臣;罗永峰;刘明;郑丽霞;陈敏慧;汪延生;付志萍;徐军;;人骨髓间充质干细胞对非特异性间质性肺炎患者成纤维细胞的影响[J];中国呼吸与危重监护杂志;2011年04期
13 熊中华;许倩;陆德云;王丽春;刘聪;赵连三;;冻存人脐血间充质干细胞向类肝细胞的诱导分化[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年07期
14 梁涛;刘浩;;间充质干细胞移植治疗椎间盘退变疾病的研究进展[J];中国修复重建外科杂志;2007年05期
15 苏永锋;霍思维;江小霞;刘元林;吴英;毛宁;张毅;;CD34~+细胞来源的树突状细胞对骨髓间充质干细胞的生物学特性影响[J];中国实验血液学杂志;2009年04期
16 李全修;陈伯华;蔡月艳;;新式分层共培养环境下人骨髓间充质干细胞诱导髓核细胞的分化[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年01期
17 谭艳芳;殷小成;熊玉娟;王艳;;黄芪甲甙对骨髓间充质干细胞分泌干细胞因子的影响[J];中国当代儿科杂志;2010年04期
18 王君;付小兵;李存保;;骨髓间充质干细胞的免疫逃逸机制[J];创伤外科杂志;2006年05期
19 王晓宇;侯玲玲;马海滨;关伟军;马月辉;;间充质干细胞对免疫细胞的抑制作用及其机制[J];中国生物化学与分子生物学报;2011年05期
20 栾希英;张学光;;间充质干细胞的免疫调节作用及其应用[J];中国医学科学院学报;2006年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 孙海梅;季凤清;王丹妮;曾晓蓓;杨慧;;优化脐血间充质干细胞的新方法[A];中国解剖学会第八届组织学与胚胎学教学与科研技术经验交流会论文摘要[C];2008年
2 李勇;许勇峰;刘正山;周畅;张成;;Microdystrophin在肌管形成中的作用[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年
3 宋永平;房佰俊;魏旭东;赵婷茹;;人脐带源Flk1~+CD31~-CD34~-间充质干细胞对表达FOXP3的异基因T淋巴细胞表型的影响[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年
4 房佰俊;宋永平;魏旭东;赵婷茹;;人脐带源Flk1~+ CD31~- CD34~-间充质干细胞对表达FOXP3的异基因T淋巴细胞表型的影响[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年
5 朱恒;江小霞;孔维霞;吴英;刘元林;李秀森;张毅;毛宁;;小鼠骨实质来源的间充质干细胞调节树突状细胞向破骨细胞分化[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
6 王巧稚;韩艺;赵宏贤;余鸿;刘广益;;当归诱导人脂肪间充质干细胞向神经细胞分化和毒性检测的研究[A];中国解剖学会第十一届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文汇编[C];2009年
7 王玉红;陈光辉;;地黄低聚糖对人脂肪组织源性间充质干细胞分泌肝细胞生长因子的影响[A];2010全国中西医结合危重病、急救医学学术会议论文汇编[C];2010年
8 杜凤移;王皓;杨树龙;赵绘存;杨英;杨军;;纳米纤维支架对大鼠间充质干细胞向肝细胞分化的影响[A];天津市生物医学工程学会第29届学术年会暨首届生物医学工程前沿科学研讨会论文集[C];2009年
9 郭勇;张西正;郭春;魏严;李瑞欣;徐晓莹;张永红;;脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化中心肌发育相关基因的表达[A];天津市生物医学工程学会2008年年会暨首届生物医学工程与临床论坛论文集[C];2008年
10 朱恒;江小霞;刘元林;张毅;毛宁;;间充质干细胞选择性调节破骨细胞发育和功能[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李东杰;人脐带间充质干细胞促进创面愈合及体外诱导分化为表皮样细胞的实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年
2 彭飞;620nm非相干红光对大鼠骨髓间充质干细胞的光生物调节作用[D];华中科技大学;2011年
3 于美娇;系统归巢的间充质干细胞在牙周组织修复再生过程中的作用研究[D];山东大学;2011年
4 李雪峰;转染LMP-1基因人脂肪间充质干细胞与退变髓核细胞体外双层细胞微球三维条件下共培养的实验研究[D];苏州大学;2012年
5 李宝军;脂肪间充质干细胞体外诱导及复合PLGA体内异位成软骨的实验研究[D];中南大学;2007年
6 朱雅姝;Flk-1~+间充质干细胞对肿瘤细胞增殖的抑制作用及其分子机制研究[D];中国协和医科大学;2008年
7 吴桂珠;脂肪间充质干细胞治疗压力性尿失禁的实验研究[D];福建医科大学;2010年
8 倪春生;小鼠骨髓间充质干细胞与恶性黑色素瘤细胞体外共培养环境中相互作用及其机制的初步研究[D];天津医科大学;2006年
9 周方宇;共培养兔髓核细胞诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化的研究[D];华中科技大学;2010年
10 熊卉;转化生长因子β1基因体外转染兔颞下颌关节滑膜间充质干细胞向纤维软骨转化实验研究[D];武汉大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 田毅;人脐带Wharton's jelly间充质干细胞的生物学特性以及其与脑肿瘤干细胞共培养的实验研究[D];郑州大学;2010年
2 陈芳;脐带间充质干细胞修复化疗所致卵巢颗粒细胞损伤的体外实验[D];暨南大学;2010年
3 王爱红;人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的初步研究[D];汕头大学;2008年
4 张琦;SOX9基因真核表达载体转染诱导间充质干细胞分化为类髓核细胞的研究[D];第四军医大学;2010年
5 章守琴;人羊膜间充质干细胞支持造血的体外研究[D];昆明医学院;2010年
6 张茜真;人脐带间充质干细胞的分离、鉴定以及干细胞特异性转录因子诱导其重编程的研究[D];浙江理工大学;2010年
7 陈义;脐带间充质干细胞培养及体外重建角膜后板层的初步研究[D];暨南大学;2010年
8 唐子滨;纳米级胶原基骨材料复合自体脂肪间充质干细胞用于兔后外侧脊柱融合的实验研究[D];河北医科大学;2010年
9 齐凯;人脐带来源间充质干细胞分离培养方法的优化初探[D];山西医科大学;2011年
10 马兰兰;不同胎龄人脐带血间充质干细胞的研究[D];中国医科大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王秋月 王琳;空军总医院采用间充质干细胞救治小脑萎缩[N];科技日报;2009年
2 记者 李素锋;我市首例间充质干细胞移植手术取得成功[N];临汾日报;2009年
3 记者 王丹 通讯员 艾素;异染性脑白质营养不良治疗获突破[N];健康报;2010年
4 冯蕾;近三年培养新技师60多万人[N];光明日报;2007年
5 记者 白毅;间充质干细胞可促进成熟树突状细胞增殖分化[N];中国医药报;2009年
6 记者 韩有存;临洮切实加强乡土人才队伍建设[N];定西日报;2008年
7 熊杰;马尔康扎实推进村级后备干部队伍建设[N];阿坝日报;2008年
8 孙文振;民族地区干部挂职锻炼工作成效显著[N];中国民族报;2007年
9 通讯员 曾广斌;抓党建促发展 求和谐[N];安康日报;2006年
10 张中桥;西京医院建立人视网膜色素上皮细胞老化模型[N];中国医药报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978