家蚕对有机磷农药的代谢抗性机制研究

【摘要】：家蚕（Bombyx mori）是重要的经济昆虫，也是鳞翅目的模式昆虫，人工驯化历史已经有5000多年。家蚕生产过程中，每年由于农药中毒造成大量减产，特别是近年来，有许多蚕区的秋蚕都放弃饲养，至今国内没有育成对农药存在明显抗性的家蚕的品种。 有机磷杀虫剂（Organophosphate,OP）是害虫防治中最常用的一种农药，桑田喷洒有机磷农药，不能彻底防治桑园害虫，反而会使家蚕中毒，这已经成为制约蚕业发展的一对矛盾。 为了研究家蚕对有机磷农药的代谢抗性机制，本文以大造和菁松×皓月为材料，研究了家蚕在添食辛硫磷农药以后3大解毒酶系（细胞色素P450氧化酶（P450s）、谷胱甘肽-s-转移酶（GSTs）和酯酶（ESTs））的活性变化情况，此外利用基因芯片研究了全基因组水平抗性相关基因的转录特征，同时利用HPLC方法研究了辛硫磷农药在家蚕体内的代谢分布特征，获得如下结果： 1解毒酶活性的研究 1.1家蚕添食辛硫磷后解毒酶活性的测定 本研究测定了5龄3d家蚕对辛硫磷的LC_(50)和辛硫磷中毒后家蚕中肠和脂肪体中P450s、GSTs和ESTs的活性水平。结果显示：5龄3d家蚕对辛硫磷的LC_(50)为7.86μg/mL （24h）。经农药诱导后，P450s在中肠和脂肪体中活力分别是对照的1.72倍和6.72倍；GSTs在中肠没有变化，在脂肪体中是对照的1.11倍；ESTs在中肠和脂肪体中分别是对照的0.69倍和1.13倍，推测其可能存在“脂族酯酶突变假说”现象。结果表明，添食辛硫磷以后，家蚕3大解毒酶活性都发生改变，说明解毒酶在代谢辛硫磷农药过程中起作用，但活性很低，推测家蚕的解毒酶活性较低是容易发生中毒的原因。本研究为进一步研究家蚕对辛硫磷农药的抗性机制提供基础。 2.2家蚕代谢辛硫磷过程中解毒酶活性变化特征分析 本实验研究了家蚕添食辛硫磷农药（5μg/头）24h内3种解毒酶的活性变化特征。结果显示，添食辛硫磷后，P450s在脂肪体中的活性高于中肠，在脂肪体中2h以后上升，24h时是对照的2.85倍；在中肠中12h达到最高值，是对照的1.89倍。GSTs在脂肪体中的活性高于中肠，在脂肪体中12h时达到最高值，是对照的1.69倍；在中肠中24h时达到最高值，是对照的1.21倍。ESTs活性在中肠中高于脂肪体，在添食0.5h之后下降，10h时降到最低，在中肠和脂肪体中分别是对照的0.15倍和0.40倍；10h后上升，24h时分别是对照的1.14倍和0.75倍。结果表明家蚕代谢辛硫磷过程中解毒酶的特征为：P450代谢解毒的主要器官是脂肪体，添毒2h后代谢作用增加；GSTs的解毒作用较为平缓；在家蚕中可能也存在酯酶的“突变学说”的现象，代谢转折时间是10h。本研究为解明三大解毒酶系在家蚕代谢有机磷农药过程中的生理作用及家蚕代谢解毒的分子机制打下基础。 2抗性相关基因的表达研究 2.1利用芯片分析辛硫磷诱导后家蚕全基因组水平基因转录特征 我们利用全基因组芯片研究了家蚕个体水平经辛硫磷诱导24h以后的基因表达情况。结果显示，与对照组相比，有247个基因表达差异显著，其中68个基因上调表达，179个基因下调表达，最高上调26倍，最低下调29倍。对差异表达的基因分析发现它们的功能分为10类。上调表达的基因主要参与糖代谢、脂肪代谢、氨基酸水解和电子传递过程等，下调表达的基因主要参与细胞分化、转录调节以及细胞间信号级联传递等。我们首次从全基因组水平研究家蚕经辛硫磷农药诱导后的基因表达水平，为我们进一步研究家蚕及其他鳞翅目昆虫代谢有机磷杀虫剂提供了新思路。 2.2家蚕肠粘蛋白基因BmIIM1的克隆及辛硫磷的诱导转录分析 本研究以5龄3d幼虫中肠为材料，通过RT-PCR克隆获得家蚕肠粘蛋白cDNA序列，命名为BmIIM1（GenBank登录号：JN256080）。序列分析表明，BmIIM1开放阅读框长度为870bp，编码289个aa，相对分子质量约为31.78kDa，等电点为4.56。通过定量PCR分析了mRNA的组织转录特征以及辛硫磷农药诱导以后的转录特征。结果显示：BmIIM1只在中肠中表达，辛硫磷诱导以后，在中肠中的转录水平是对照的12.3倍，推测该基因在家蚕保护中肠组织免受辛硫磷农药毒害中发挥重要作用。本研究为进一步研究家蚕IIM基因的功能打下基础，也为昆虫IIM和杀虫剂的作用关系提供参考。 2.3辛硫磷诱导后家蚕乙酰胆碱酯酶基因的转录表达特征分析 本文研究了辛硫磷诱导24、48、72及96h后家蚕乙酰胆碱酯酶基因(Acetylcholinesterase Gene, ace)的转录表达特征。结果显示，Bm-AChE-1和Bm-AChE-2在家蚕脑、脂肪体和丝腺中的转录均表现为先上升后下降的变化规律，其中在脑组织中24h两者的上升幅度最大，分别达16.22和68.71倍；在脂肪体和丝腺中的变化幅度较小；在中肠中两基因均表现出先下降后上升的特点。结果表明，在家蚕对辛硫磷的解毒过程中，不同组织内Bm-AChE-1和Bm-AChE-2的转录表达存在差异，Bm-AChE-1在脂肪体代谢农药过程中发挥重要作用，Bm-AChE-2在脑中起重要作用。本研究为深入研究昆虫两种乙酰胆碱酯酶基因的功能提供参考。 2.4家蚕经辛硫磷诱导后中肠和脂肪体中基因的转录特征 为了研究家蚕中肠和脂肪体中的基因在代谢辛硫磷农药中的作用，本研究利用全基因组芯片研究了5龄3d幼虫经辛硫磷农药（4μg/mL）诱导24h后中肠和脂肪体中基因的转录表达特征。结果显示，经辛硫磷诱导后中肠中有299个基因显著差异表达，其中上调209个，下调90个；脂肪体中显著差异表达的基因有1040个，其中上调表达569个，下调表达471个。GO功能分析显示，中肠中差异表达的基因功能主要分为8类，有168个基因功能已知；脂肪体中差异表达的基因功能主要分为11类，有639个功能已知。对上调表达基因CYP4G25（sw20730）和CYP9a21（sw20566）进行了定量PCR验证，结果和芯片杂交结果一致。研究结果表明，经辛硫磷农药诱导以后，家蚕体内脂联素受体基因（sw09106）、CYP4G25（sw20730）、细胞凋亡相关的基因（sw04971）等高水平表达，并出现辛硫磷引起细胞损伤的症状，由此引起多种生物学过程发生变化。通过对中肠进行病理切片，证明经辛硫磷诱导后中肠出现圆筒形细胞死亡，杯状细胞裂解，肠膜破碎等症状。本研究为阐明昆虫对辛硫磷的抗性及辛硫磷对昆虫的毒害和损伤机理打下基础。 3利用HPLC分析辛硫磷在家蚕体内的代谢分布特征 为了研究辛硫磷在鳞翅目昆虫体内不同组织中的代谢特征，本文以家蚕（菁松×皓月）为研究对象，用高效液相色谱法测定了不同时间中肠、血液、脂肪体和丝腺中辛硫磷的含量。结果表明，中肠中辛硫磷含量在添食0.5h时达到最高值4.35μg/g，0.5h降低；血液中辛硫磷含量在1h时达到最高值1.72μg/mL；脂肪体中辛硫磷含量在注射后上升，4h时达到最高值3.65μg/g，4h之后下降；丝腺中辛硫磷含量比较稳定，24h达到最高值1.45μg/g。辛硫磷农药的其代谢特征是：辛硫磷通过家蚕中肠后，经过血液的运输，在脂肪体内积累代谢，在丝腺中具有积累储存的作用。通过研究辛硫磷在家蚕体内的代谢分布特征，对于深入研究各组织在代谢解毒中的功能具有重要的参考价值。 通过本课题的开展，从酶活水平、基因水平及药物代谢分布水平研究了家蚕对辛硫磷农药的代谢抗性机制，同时初步探讨了辛硫磷农药对家蚕的损伤机制。通过本课题的研究，为家蚕抗性品种的转基因选育提供理论依据，此外，研究鳞翅目的模式昆虫家蚕对有机磷农药的代谢抗性，对于开发针对鳞翅目害虫的高效杀虫剂具有重要意义。