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促肾上腺皮质激素与转化生长因子β1对足细胞表型的影响

梁斌  
【摘要】:目的:分别观察促肾上腺皮质激素(ACTH1-24和ACTH4-10)和转化生长因子β1(TGF-β1)对正常足细胞裂孔膜蛋白分子podocin核酸水平,纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,a-SMA)蛋白水平的影响,以期能够探讨ACTH1-24和ACTH4-10对肾脏足细胞表型的影响以及预防性保护机制,并明确在预防性保护TGF-β1对正常肾脏足细胞的损伤方面,ACTH1-24和ACTH4-10发挥的作用是否相似。 方法:1.细胞培养:根据文献将复苏的条件永生型小鼠足细胞系MPC5细胞,于33℃中增殖培养,平均3~4d达80%以上融合传代,更换于37℃中培养,平均10~14d分化为成熟,此时为分化态MPC5,观察正常状态下足细胞的形态,细胞状态良好时可以用于实验;将细胞接种于六孔板,试验前用无血清RPMI1640培养液调整细胞生长状态,使细胞同步化。 2.细胞分组:将细胞分为ACTH1-24预防实验组和ACTH4-10预防实验组,ACTH1-24处理组和ACTH4-10处理组又分别分为A,B两组,A组:预先加入ACTH1-24(或ACTH4-10)处理1h,后加入TGF-β1处理24h;B组:预先加入ACTH1-24(或ACTH4-10)处理1h,后加入TGF-β1处理48h。根据文献,ACTH1-24分别设低浓度(75ng/ml)、中浓度(150ng/ml)、高浓度(300ng/ml)三种浓度刺激足细胞;ACTH4-10亦分别设低浓度(1ng/ml)、中浓度(10ng/ml)、高浓度(100ng/ml)三种浓度刺激足细胞;根据文献,选取2ng/ml为TGF-β1处理足细胞浓度,刺激时间为24h与48h。 3.检测指标:足细胞裂孔膜蛋白分子podocin mRNA表达水平,纤维连接蛋白(FN)和平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达水平。 结果:ACTH1-24预防实验组:与对照组相比,TGF-β1处理组的podocin的核酸表达水平明显降低,降低约54.9%;FN的蛋白表达水平明显升高,升高约2.3倍;α-SMA的蛋白表达水平明显升高,升高约2.4倍。与对照组相比,ACTH1-24处理组的podocin的核酸表达水平升高,升高约7.5%;FN的蛋白表达水平降低,降低约0.1%;α-SMA的蛋白表达水平升高,升高约1.7%。与对照组相比,ACTH1-24低、中、高三种浓度与TGF-β1处理组podocin的核酸表达水平呈现上升趋势,分别升高1.3倍、2.4倍、1.2倍;而与TGF-β1处理组相比,FN的蛋白表达水平呈现下降趋势,分别下降0.1%、7.3%、40.1%;与TGF-β1处理组相比,ACTH1-24低、中浓度与TGF-β1处理组a-SMA的蛋白表达水平呈现上升趋势,分别升高约4.5%,11.8%;ACTH1-24高浓度与TGF-β1处理组a-SMA的蛋白表达水平降低,降低约22.4%。 ACTH4-10预防实验组:与对照组相比,TGF-β1处理组的podocin的核酸表达水平明显降低,降低约57.9%;FN的蛋白表达水平明显升高,升高约18.6倍;a-SMA的蛋白表达水平明显升高,升高约90.6%。与对照组相比,ACTH4-10处理组的podocin的核酸表达水平升高,升高约8.3%;FN的蛋白表达水平升高,升高约4.8%;a-SMA的蛋白表达水平升高,升高约28.9%。与对照组相比,ACTH4-10低、中、高三种浓度与TGF-β1处理组podocin的核酸表达水平呈现上升趋势,分别升高5.5%,64.3%,1.7倍;而与TGF-β1处理组相比,ACTH4-10低、中浓度与TGF-β1处理组FN的蛋白表达水平呈现上升趋势,分别升高约8.8%,9.2%;ACTH4-10高浓度与TGF-β1处理组FN的蛋白表达水平降低,降低约13.1%;与TGF-β1处理组相比,ACTH4-10低浓度与TGF-β1处理组a-SMA的蛋白表达水平升高,升高约3.8%;ACTH4-10中、高浓度与TGF-β1处理组a-SMA的蛋白表达水平呈现下降趋势,分别降低约5.6%,35.5%。 结论:ACTH1-24与ACTH4-10都可以直接作用于足细胞,稳定足细胞裂孔膜蛋白分子podocin的表达,从而维持裂孔隔膜(SD)结构和功能的完整,同时,ACTH1-24可以抑制细胞外基质成分纤维连接蛋白(FN)以及平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的升高,从而拮抗TGF-β1对足细胞的表型改变,发挥保护足细胞的作用。在拮抗TGF-β1导致的足细胞表型改变以及对足细胞的预防保护方面,ACTH4-10与ACTH1-24发挥的作用相似,但具体的起效药物浓度略有不同。


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