自噬抑制氧化低密度脂蛋白在人血管内皮细胞聚集的作用及机制探讨

【摘要】：目的： 观察自噬对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中聚集的影响。 方法： 1.运用不同时间点的Dil-ox-LDL处理HUVECs，采用流式细胞技术检测HUVECs中Dil-ox-LDL的含量。 2.在自噬诱导剂雷帕霉素和抑制剂3甲基腺嘌呤（3MA）干预下，观察自噬对Dil-ox-LDL在HUVECs中聚集的影响。 3.在雷帕霉素和3MA干预下，通过免疫荧光技术观察HUVECs中Dil-ox-LDL与自噬标记物LC3以及溶酶体标记物LAMP1的共定位情况，以及HUVECs中LC3与LAMP1的共定位情况，初步探讨自噬抑制HUVECs中ox-LDL聚集的可能机制；采用蛋白免疫印迹方法检测自噬流相关蛋白LC3、beclin1、LAMP1、P62的蛋白含量，进一步证实自噬参与了ox-LDL在HUVECs中的降解。 结果： 1.流式细胞术检测结果显示Dil-ox-LDL在HUVECs中的积聚量随时间点的延长而增加，3h细胞内Dil-ox-LDL是0小时的8.53倍，3h时间点下雷帕霉素可抑制HUVECs中ox-LDL的积聚（P=0.003）而3MA能够增加HUVECs中ox-LDL的积聚（P=0.035）。 2.免疫荧光技术显示3h时间点下，Dil-ox-LDL与LC3及LAMP1发生大量共定位，此时LC3与LAMP1也大量共定位，同时Dil-ox-LDL与LC3及LAMP1、LC3与LAMP1的共定位能够被雷帕霉素增加，被3MA所抑制。 3.免疫印迹技术结果显示，ox-LDL作用于HUVECs3h后，LC3-II/LC3-I（P=0.024）、beclin1（P=0.005）及LAMP1（P＜0.001）蛋白表达明显增加，P62蛋白水平降低（P＜0.001）；与ox-LDL组相比雷帕霉素能够进一步增加LC3-II/LC3-I（P=0.045）和beclin1（P=0.001）蛋白表达，降低P62（P=0.030）蛋白表达；与ox-LDL组相比3MA能够降低LC3-II/LC3-I（P＜0.001）和beclin1（P＜0.001）蛋白表达，增加P62（P＜0.001）蛋白表达。 结论： ox-LDL在HUVECs中聚集随着作用时间的延长而增加，雷帕霉素作用后可抑制ox-LDL在HUVECs中聚集，雷帕霉素上调ox-LDL作用后HUVECs中自噬流水平，增高的自噬流促进自噬泡对ox-LDL吞噬，进一步和溶酶体融合后，在自噬溶酶体中降解，自噬溶酶体通路参与HUVECs中ox-LDL的降解。