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抗凋亡蛋白Bcl-2在自噬调控以及细胞生存中的机制研究

徐海东  
【摘要】:目的:抗凋亡蛋白Bcl-2在急性饥饿时,通过与自噬关键蛋白Beclin1的相互作用,抑制Beclin1诱导的自噬,但是在某些情况下,Bcl-2的过表达并不能抑制自噬活性,因此抗凋亡蛋白Bcl-2和自噬之间的关系有待进一步研究。本研究的目的是探讨抗凋亡蛋白Bcl-2在自噬调控中的作用及其在细胞生存和死亡中的意义。 方法:利用血清饥饿和自噬激动剂雷帕霉素(Rapamycin)在人神经母细胞瘤SH-SY5Y中,激活自噬,Western检测自噬相关蛋白Beclin1,LC3,p62和CathepsinD,确定自噬激活模型成功;检测Bcl-2家族蛋白变化;利用siRNA Knockdown Bcl-2,或者应用Bcl-2的小分子抑制剂拮抗Bcl-2的功能,用MTT法检测细胞在饥饿下的活力变化,用Annexin-V/PI检测细胞凋亡的改变;加入自噬不同阶段的抑制剂,3-MA,E64D和Bafilomycin A1,检测在Bcl-2被下调或被小分子抑制剂拮抗时,血清饥饿诱导的自噬对细胞活力的影响。 结果:利用血清饥饿SH-SY5Y细胞6,12,24,36,48小时,Western检测自噬蛋白Beclin1,LC3,Cathepsin D和p62,结果显示Beclin1,LC3和Cathepsin D在血清饥饿时均上调,而自噬底物p62在6小时一过性下调,提示自噬被激活;用自噬激动剂雷帕霉素同样激活了自噬;在自噬被激活时,检测到抗凋亡蛋白Bcl-2上调;用siRNA干扰Bcl-2蛋白表达水平,检测到LC3无变化,加入溶酶体抑制剂氯化铵,LC3出现堆积,并且自噬底物p62被进一步降解,提示自噬流量进一步增强;在Bcl-2被下调时,或者应用小分子抑制剂HA14-1和ABT-737拮抗Bcl-2的功能活性时,MTT结果显示,血清饥饿进一步使细胞活力下降,Annexin V/PI结果显示细胞发生早期和晚期凋亡;泛caspase抑制剂Z-VAD阻断细胞死亡证实部分细胞死亡是凋亡性的;应用自噬不同阶段的抑制剂,E64D和巴普洛霉素(Bafilomycin A1)抑制自噬,可以挽救血清饥饿导致的部分细胞死亡。这些结果表明,伴随自噬激活而上调的Bcl-2蛋白能够限制自噬的过度激活和保护营养应激下的细胞死亡,当Bcl-2被下调时,自噬进一步激活,并且细胞发生死亡,这种死亡是凋亡性的,同时又是自噬性,因为caspase的抑制剂和自噬的抑制剂都能够挽救部分细胞死亡。 结论:营养剥夺诱导的自噬激活在生理条件下是保护性的,当Bcl-2下调时,抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白,抗自噬蛋白与促自噬蛋白之间的力量对比发生变化,这时候,上调自噬活性可以导致营养应激条件下的细胞死亡,提示自噬的保护性作用依赖于抗凋亡蛋白Bcl-2,一旦Bcl-2下调或者功能受损,自噬的激活对细胞死亡有贡献。


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