β-TcP/pluronicF-127复合支架结合BMSCs修复兔关节骨软骨缺损的实验研究

【摘要】：第一部分：凋亡相关基因在骨关节炎软骨中的表达及意义目的:研究骨关节炎中细胞凋亡情况，凋亡相关基因(FAS、BCL-2、caspases3)等在骨关节炎中的表达及意义，从而在一定程度阐明骨关节炎的发病机理。方法:通过Hulth法建立兔关节炎模型取得软骨标本，免疫组化S-P法检测凋亡相关基因(FAS、BCL-2、caspases3)在骨性关节炎软骨细胞中的表达情况，TUNEL法检测骨性关节炎软骨细胞凋亡情况，并探讨凋亡相关基因(FAS、BCL-2、caspases3)的表达与软骨细胞凋亡程度之间的相关性。结果:术后8周时关节软骨呈现典型的0A病理特征。实验组和对照组关节软骨细胞凋亡指数的差异具有显著性(P0.05);在软骨细胞中FAS蛋白表达实验组阳性率高于对照组，差异具有显著性(P0.05);实验组关节软骨中软骨细胞凋亡程度与FAS蛋白的表达呈正相关，差异具有显著性(P0.05)；在关节软骨细胞中bcl-2蛋白的表达实验组阳性率低于对照组，但差异没有显著性(P0.05);实验组关节软骨中软骨细胞凋亡程度与bcl-2蛋白的表达呈负相关，差异具有显著性(P0.05); caspase-3在实验组的软骨细胞阳性率高于对照组，差异具有显著性(P0.01);实验组关节软骨中软骨细胞凋亡程度与caspase3的表达呈正相关，差异具有显著性(p0.05);结论:1.Hulth法可制作较好的骨关节炎动物模型。2.关节软骨细胞的凋亡明显增加可能是关节炎形成的重要原因之一。3.骨关节炎中FAS,BCL-2,caspase3等凋亡相关基因的表达与细胞凋亡程度具有明显相关性，表明表达其与骨关节炎有密切关系。 第二部分兔骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及体外诱导分化 目的:探索兔骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及体外诱导分化的方法，研究其体外增殖，分化能力。探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值。方法:采用密度梯度离心与全骨髓培养结合的方法分离、纯化兔骨髓间充质干细胞，体外培养;以流式细胞仪检测BMSCs的表面抗原表达;在相差显微镜下观察细胞形态并绘制生长曲线;分别体外诱导第3代细胞向软骨细胞和骨细胞分化，对诱导分化为骨细胞进行碱性磷酸酶染色、VonKossa染色和I型胶原和骨钙素免疫组化染色检测鉴定，对诱导分化为软骨细胞进行甲苯胺蓝染色、番红O染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色检测鉴定。结果:经密度梯度离心结合全骨髓培养法分离所得到的细胞形态均一，呈长梭形或纺锤形。BMSCs增殖能力活跃,流式细胞仪检测BMSCs显示CD105,CD44,表达阳性，CD34和CD45表达为阴性。成骨诱导培养后，可见碱性磷酸酶染色、VonKossa染色、I型胶原和骨钙素免疫组化染色阳性;向软骨细胞诱导分化后，细胞甲苯胺蓝染色、番红0染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色为阳性。结论:密度梯度分离法与全骨髓培养法结合能理想的分离、纯化BMSCs; BMSCs在体外具有良好的增殖潜能，BMSCs在诱导剂作用下能表现出成骨细胞和软骨细胞生物学特性，是组织工程理想的种子细胞。 第三部分BMscs/β-TcP/pluronicF-127复合支架修复兔关节软骨缺损的实验研究 目的:研究β-TcP/pluronicF-127复合支架结合BMSCs修复兔膝关节骨软骨缺损的效果，探讨β-TcP/pluronicF-127复合支架做为组织工程支架承载BMSCs修复骨软骨缺损的可行性。方法:分离培养兔自体MSCs，将36只健康新西兰大白兔并随机分为三组(A组、B组、C组)，于股骨髁关节面制备关节软骨缺损模型(每孔直径5mm、深度4-5mm)。A组、B组关节缺损处分别植入BMscs/β-TcP/pluronicF-127.、BMscs/β-TcP复合支架，C组为空白组不作处理。术后3、6个月分别取材，进行缺损区组织学、组织化学和免疫组织化学分析。A组、B组和正常关节标本进行生物力学测试。结果:A组能形成丰富的透明软骨样修复组织，与周围组织整合良好;B组以不成熟透明软骨;C组无修复组织。总的修复效果A组最理想，C组最差。生物力学测试得出: B组和C组标本的蠕变时间和应力松弛时候较正常关节均缩短，杨氏模量较正常关节偏小，但差异均无统计学意义。结论: BMSCs是良好的组织工程种子细胞，β-TcP/pluronicF-127复合支架是良好的生物工程支架,能承载BMSCs至缺损区修复骨软骨缺损缺损，修复效果理想。BMscs/β-TcP/pluronicF-127复合支架材料构建组织工程软骨，是—种修复关节软骨缺损行之有效的方法。