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Ad-ING4-OSM双基因共表达对SPC-A1肺腺癌移植瘤的抑瘤增效和放疗增敏的实验研究

祝国风  
【摘要】:目的:研究腺病毒介导的ING4和OSM双基因共表达对SPC-A1肺腺癌裸鼠移植瘤的抑瘤增效和放疗增敏作用及其分子机制。 方法:构建AdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter(简称Ad-ING4)、AdTrack-CMV-poly-A-promoter-OSM (简称Ad-OSM)、 AdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM(简称Ad-ING4-OSM)单双基因重组病毒,将上述病毒转染QBI-293A细胞,经多轮感染扩增、纯化后测定效价,-80℃保存备用。用RT-PCR鉴定ING4/OSM基因在QBI-293A细胞中的有效表达。培养SPC-A1肺腺癌细胞,建立SPC-A1肺腺癌裸鼠移植瘤模型。对已成瘤的裸鼠随机分组,共七组,分别是:PBS组、Ad组、ING4组、OSM组、放疗组、ING4/OSM双基因组、ING4/OSM+放疗组。对各组裸鼠进行抗肿瘤实验,方案如下:(1)PBS组:瘤内多点注射PBS液,剂量100ul/只,隔日一次,共五次;(2)Ad组、Ad-ING4组、Ad-OSM组、Ad-ING4/OSM双基因组:瘤内多点注射各重组腺病毒,剂量为1.0*10~8/100ul/只,隔日一次,共五次;(3)放疗组:抗肿瘤实验的第0d对裸鼠进行局部瘤体照射,剂量为10Gy/只,共一次;(4)Ad-ING4/OSM+放疗组:瘤体内多点注射Ad-ING4/OSM双基因重组病毒,剂量剂量为1.0*10~8/100ul/只,隔日一次,共五次;治疗5d后局部进行瘤体照射,照射剂量同放疗组。抗肿瘤实验开始后隔日用游标卡尺测量各瘤体长、短径,计算体积,绘制瘤体体积-时间曲线,观察抑瘤效果,治疗结束5d后处死裸鼠摘取瘤体,称重,计算抑瘤率,将摘取的瘤体切片,HE染色观察各治疗组的细胞凋亡情况,免疫组化检测凋亡相关蛋白及肿瘤血管形成相关因子Bax、Bcl-2、Caspase-3、Fasl、Survivin、VEGF的表达。 结果:成功构建了载有ING4和OSM单双基因的重组腺病毒,各重组病毒效价均达到1.0~2.0*10~9/ml的病毒。RT-PCR证实ING4/OSM能够在QBI-293A细胞中有效表达。裸鼠模型的抗肿瘤实验证实Ad-ING4、Ad-OSM、放疗组、Ad-ING4-OSM、Ad-ING4-OSM联合放疗组均对肺腺癌SPC-A1裸鼠移植瘤有不同程度的抑制作用,且与PBS组、Ad-GFP空载体腺病毒组比较有显著统计学意义(P<0.01),Ad-ING4-OSM基因组的抑瘤效应明显优于Ad-ING4和Ad-OSM基因组,呈现抑瘤叠加效应(Q=1.10),而双基因联合放疗组抑瘤效应最强,呈现放疗增敏效应(Q=1.04)。HE染色下观察凋亡情况,不仅双基因组较单基因组、Ad组、PBS组细胞凋亡明显,而且双基因联合放疗组较双基因组、单独放疗组凋亡更明显。分子机制检测结果表明:Ad-ING4、Ad-OSM、放疗组、Ad-ING4-OSM、Ad-ING4-OSM+放疗组不仅均能明显上调SPC-A1肺腺癌细胞促凋亡因子Bax、Caspase-3、FASL的表达,并下调抑制凋亡的Bcl-2、Survivin蛋白的表达,而且还能明显下调肿瘤血管形成因子VEGF的表达,双基因组较单基因组、Ad组、PBS组调节上述因子的效果更明显(P<0.01),双基因联合放疗优于单独放疗组、双基因组(P<0.01)。 结论:(1)成功构建各基因重组腺病毒,并扩增获得大量高纯度、高滴度的病毒液;(2)体内实验证实腺病毒介导的ING4/OSM双基因共表达对SPC-A1肺腺癌裸鼠移植瘤具有明显的抑瘤增效和放疗增敏作用;(3)抑瘤的分子机制可能与上调SPC-A1肺腺癌细胞促凋亡因子Bax、Caspase-3、Fasl的表达、下调抑制凋亡的Bcl-2、Survivin蛋白的表达及下调肿瘤血管形成因子VEGF的表达有关。 本实验证实ING4/OSM双基因对肺癌的治疗效果优于单基因,具抑瘤增效作用,且联合放疗的治疗效果最佳,具放疗增敏效应,是理想的放疗增敏剂,为今后临床应用双基因联合放疗的治疗方案提供了有效的实验依据。


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