Ad-ING4-OSM双基因共表达对SPC-A1肺腺癌移植瘤的抑瘤增效和放疗增敏的实验研究

【摘要】：目的：研究腺病毒介导的ING4和OSM双基因共表达对SPC-A1肺腺癌裸鼠移植瘤的抑瘤增效和放疗增敏作用及其分子机制。 方法：构建AdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter(简称Ad-ING4)、AdTrack-CMV-poly-A-promoter-OSM (简称Ad-OSM)、 AdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM(简称Ad-ING4-OSM)单双基因重组病毒，将上述病毒转染QBI-293A细胞，经多轮感染扩增、纯化后测定效价，-80℃保存备用。用RT-PCR鉴定ING4/OSM基因在QBI-293A细胞中的有效表达。培养SPC-A1肺腺癌细胞，建立SPC-A1肺腺癌裸鼠移植瘤模型。对已成瘤的裸鼠随机分组，共七组，分别是：PBS组、Ad组、ING4组、OSM组、放疗组、ING4/OSM双基因组、ING4/OSM+放疗组。对各组裸鼠进行抗肿瘤实验，方案如下：（1）PBS组：瘤内多点注射PBS液，剂量100ul/只,隔日一次，共五次；（2）Ad组、Ad-ING4组、Ad-OSM组、Ad-ING4/OSM双基因组:瘤内多点注射各重组腺病毒，剂量为1.0*10~8/100ul/只,隔日一次，共五次；（3）放疗组：抗肿瘤实验的第0d对裸鼠进行局部瘤体照射，剂量为10Gy/只，共一次；（4）Ad-ING4/OSM+放疗组：瘤体内多点注射Ad-ING4/OSM双基因重组病毒，剂量剂量为1.0*10~8/100ul/只，隔日一次，共五次；治疗5d后局部进行瘤体照射，照射剂量同放疗组。抗肿瘤实验开始后隔日用游标卡尺测量各瘤体长、短径，计算体积，绘制瘤体体积-时间曲线，观察抑瘤效果，治疗结束5d后处死裸鼠摘取瘤体，称重，计算抑瘤率，将摘取的瘤体切片，HE染色观察各治疗组的细胞凋亡情况，免疫组化检测凋亡相关蛋白及肿瘤血管形成相关因子Bax、Bcl-2、Caspase-3、Fasl、Survivin、VEGF的表达。 结果：成功构建了载有ING4和OSM单双基因的重组腺病毒,各重组病毒效价均达到1.0~2.0*10~9/ml的病毒。RT-PCR证实ING4/OSM能够在QBI-293A细胞中有效表达。裸鼠模型的抗肿瘤实验证实Ad-ING4、Ad-OSM、放疗组、Ad-ING4-OSM、Ad-ING4-OSM联合放疗组均对肺腺癌SPC-A1裸鼠移植瘤有不同程度的抑制作用，且与PBS组、Ad-GFP空载体腺病毒组比较有显著统计学意义（P＜0.01），Ad-ING4-OSM基因组的抑瘤效应明显优于Ad-ING4和Ad-OSM基因组，呈现抑瘤叠加效应（Q=1.10），而双基因联合放疗组抑瘤效应最强，呈现放疗增敏效应（Q=1.04）。HE染色下观察凋亡情况,不仅双基因组较单基因组、Ad组、PBS组细胞凋亡明显，而且双基因联合放疗组较双基因组、单独放疗组凋亡更明显。分子机制检测结果表明：Ad-ING4、Ad-OSM、放疗组、Ad-ING4-OSM、Ad-ING4-OSM+放疗组不仅均能明显上调SPC-A1肺腺癌细胞促凋亡因子Bax、Caspase-3、FASL的表达，并下调抑制凋亡的Bcl-2、Survivin蛋白的表达，而且还能明显下调肿瘤血管形成因子VEGF的表达，双基因组较单基因组、Ad组、PBS组调节上述因子的效果更明显（P＜0.01），双基因联合放疗优于单独放疗组、双基因组（P＜0.01）。 结论：（1）成功构建各基因重组腺病毒，并扩增获得大量高纯度、高滴度的病毒液；（2）体内实验证实腺病毒介导的ING4/OSM双基因共表达对SPC-A1肺腺癌裸鼠移植瘤具有明显的抑瘤增效和放疗增敏作用；（3）抑瘤的分子机制可能与上调SPC-A1肺腺癌细胞促凋亡因子Bax、Caspase-3、Fasl的表达、下调抑制凋亡的Bcl-2、Survivin蛋白的表达及下调肿瘤血管形成因子VEGF的表达有关。 本实验证实ING4/OSM双基因对肺癌的治疗效果优于单基因，具抑瘤增效作用，且联合放疗的治疗效果最佳，具放疗增敏效应，是理想的放疗增敏剂，为今后临床应用双基因联合放疗的治疗方案提供了有效的实验依据。