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TIGAR通过增加NADPH在脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用

李梅  
【摘要】:目的:观察脑缺血对TIAGR表达的影响;TIGAR对缺血性神经损伤的影响和TIGAR发挥神经保护作用的初步机制。 方法:采用小鼠短暂性大脑中动脉阻塞再灌注(transient middle cerebral arteryocclusion/reperfusion, MCAO/R)模型和体外培养原代神经元缺糖缺氧/复糖复氧(oxygen glucose dripivation/reoxygenation,OGD/R)模型。在动物模型上,免疫荧光法和Western blot检测TIGAR表达的细胞类型。Western blot和实时荧光定量(RT-PCR)法检测小鼠大脑缺血皮层TIGAR的mRNA,p53和NOX4蛋白表达的变化。Westernblot检测p53的抑制剂(Pifithrin-α,PFT-α)对小鼠缺血皮层区TIGAR表达的影响。DHE探针标记检测大脑缺血皮层内ROS变化。由慢病毒构建的过表达TIGAR和沉默TIGAR通过侧脑室注射小鼠脑内,免疫荧光法和Western blot检测TIGAR感染率和蛋白表达;以脑梗死体积、脑水肿和行为学症状等指标评价TIGAR对缺血性脑损伤的影响。在培养原代神经元中给予慢病毒构建的过表达TIGAR和沉默TIGAR处理后,免疫荧光和Western blot检测TIGAR感染率和蛋白表达;CCK-8、LDH、TUNEL检测TIGAR对OGD/R诱导神经元死亡的保护作用。DCFH2-DA和JC-1探针标记流式细胞术检测NADPH对OGD/R诱导细胞内ROS水平和线粒体膜电位的影响;Western blot检测OGD/R引起的细胞凋亡蛋白caspase-3蛋白表达变化;CCK-8、LDH、TUNEL检测NADPH对OGD/R诱导细胞死亡的保护作用,通过脑梗死体积、神经症状评分、脑含水量测定检测NADPH、NOX的抑制剂apocynin、VAS2870对脑损伤程度的影响。 结果:与胶质细胞相比,TIGAR高表达在神经元细胞中(P0.01)。Western blot和RT-PCR结果显示:缺血再灌后TIGAR,p53, NOX4表达增加;PFT-α没有抑制缺血再灌注引起的TIGAR表达的增加。在脑缺血再灌注后ROS在0.5h和12h出现两个峰值(P0.01)。慢病毒构建的TIGAR能够有效地地侵染脑组织,可提高或沉默TIGAR的表达(P0.05, P0.01);过表达TIGAR能显著减少tMCAO小鼠脑梗死体积,降低脑含水量,改善行为学症状(P0.05, P0.01)。在原代培养神经元中慢病毒构建的过表达或干扰TIGAR有效地增加或降低TIGAR的表达。CCK-8、LDH、TUNEL结果显示:过表达TIAGR能显著地减少OGD/R诱导的神经元死亡(P0.05, P0.01);干扰TIGAR加重OGD/R诱导的神经元损伤。NADPH显著地抑制沉默TIGAR诱导的神经元死亡。流式细胞术分析结果显示:过表达TIGAR显著地减少OGD/R诱导的细胞内ROS水平的增强和抑制线粒体膜电位的降低;干扰TIGAR则增加细胞内ROS水平和降低线粒体膜电位,而NADPH阻断了干扰TIGAR的作用。Western blot显示:过表达TIGAR降低OGD/R诱导的caspase-3的活化;干扰TIGAR增强OGD/R诱导的caspase-3的活化。联合应用NADPH和NOX的抑制剂比单应用NADPH对减小脑梗死体积,减轻脑水肿,改善小鼠的神经行为学障碍更为显著。结论:TIGAR对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用,其作用机制可能与增强内源性抗氧化剂NADPH抑制ROS,抑制神经细胞凋亡。外源NADPH对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。


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