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家蚕BmNADK基因的克隆分析及其与家蚕高温应激反应的相关研究

金鑫  
【摘要】:NAD kinas(eNADK)是唯一一个能够从头合成NADP+的酶,其能利用ATP,催化NAD+和NADH发生磷酸化,生成NADP+和NADPH。本文利用RT-PCR、qRT-PCR、RNAi和酶活的测定等技术,研究BmNADK基因在家蚕自身氧化还原系统中的调控机制;进一步探究了BmNADK基因在同一家蚕品种5龄的不同发育阶段高温应激反应表达机制和不同抗高温家蚕品种的表达差异。结果如下: 1家蚕NADK基因的克隆及其会下调使得NADPH含量和GSH含量下降 利用RACE技术,分别延伸NADK(SilkDB登录号为BGIBMGA007449-TA)基因的5′及3′端序列,并获得了NADK基因的cDNA序列,定位在3号染色体,与玉带凤蝶的基因进化距离最近。本文还对家蚕5龄幼虫期NADK基因进行了时空表达分析,发现其在摇摆期的表达量较高;我们选择在摇摆期对其进行RNAi实验,结果表明,伴随这NADK基因表达量的下降,其摇摆期的时间会有所缩短;NADPH、NAD+、NADH、NADP+的含量以及GSH和H2O2的含量调查发现,NADPH的含量和GSH的含量下降,H2O2和NAD+的含量上升。说明NADK基因参与到家蚕氧化还原系统,主要是通过影响此系统中的NADPH、GSH等物质的含量。 2家蚕NADK基因与高温应激存在关联 本文以家蚕大造品种为材料进行34℃高温处理,分别调查了雌蚕和雄蚕的脂肪体、中肠、丝腺3个组织,结果显示,随着高温处理时间增加,NADK基因表达量都有所上升,雄蚕的组织中NADK基因上调比雌蚕更为明显,并且在脂肪体组织中上调最为显著。为进一步证明NADK基因的功能,我们选择了42℃3h处理大造,仍然调查雌蚕和雄蚕的脂肪体、中肠、丝腺3个组织,结果表明42℃短时刺激使得NADK基因的表达量显著高于常温组,这一现象在雄蚕和脂肪体中最为明显,当温度恢复常温时,其表达量也会有所下降。说明家蚕NADK基因和高温是相关的。 3高温引起不同抗高温品种家蚕体内NADK基因表达产生差异 以家蚕抗高温品种“7532”和不抗高温品种“皓月”为材料进行34℃高温处理,分别调查雌雄蚕的脂肪体、中肠和丝腺组织,结果表明,NADK基因的表达在两个品种间有差异,并且抗性强的品种7532,其表达量偏高,这说明NADK基因能影响家蚕的抗氧化能力,与不同蚕品种的抗高温性存在一定关系。


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