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HGF/c-Met相关信号通路在大鼠肝脏祖细胞增殖中的作用

臧金锋  
【摘要】:第一部分正常大鼠肝脏祖细胞的分离和鉴定 目的:探讨正常大鼠肝脏祖细胞的分离和和鉴定方法。 方法:选择正常Wistar大鼠,以CD90.1为标志物,通过免疫磁珠法分离正常肝脏内的祖细胞,应用免疫组织化学和PCR对所分离细胞的标志物进行鉴定。 结果:CD90.1阳性细胞占肝脏非实质细胞的0.32%,流式细胞仪分析CD90.1阳性细胞占分离所得细胞的98.2%。刚分离的CD90.1阳性细胞,OV-6阳性,CK-19呈强阳性,HNF-4a呈阴性。 结论:正常大鼠肝脏内存在祖细胞标记的细胞。 第二部分正常大鼠肝脏祖细胞的体外培养和诱导分化 目的:探讨将从正常大鼠肝脏内分离的祖细胞进行体外培养,并诱导其向肝细胞方向分化的技术。 方法:将正常大鼠肝脏内分离的CD90.1阳性细胞,使用含有不同浓度HGF的培养液,通过噻唑蓝(MTT)比色法观察肝脏祖细胞的增殖情况,通过IHC和实时定量RT-PCR观察肝脏祖细胞的分化情况。 结果:原代培养时,使用50ng/ml HGF的培养液,肝脏祖细胞生长良好,培养至3周左右形成形态完整的细胞集落。传代培养时,使用30ng/ml HGF的培养液中,细胞生长、分化良好,培养至8周,细胞增大至正常肝细胞大小。免疫组化分析提示,刚分离的肝脏祖细胞,CK-19、AFP呈强阳性,HNF-4a、ALB呈阴性;培养至8周,CK-19、AFP呈阴性,HNF-4a、ALB呈现强阳性。实时定量RT-PCR检测表明,刚分离的肝脏祖细胞,CK-19、AFP mRNA表达程度较高,HNF-4a、ALBmRNA几乎无表达;培养至8周,CK-19、AFP mRNA几乎无表达,HNF-4a、ALB mRNA表达水平较高。 结论:正常大鼠肝脏内的祖细胞可以在体外培养增殖,并通过诱导分化为具有肝细胞标记的细胞,HGF在此过程中发挥重要作用。 第三部分HGF/c-Met相关信号通路在大鼠肝脏祖细胞增殖中的作用 目的:探讨HGF/c-Met相关信号通路PI3K/AKT、STAT3和ERK1在大鼠肝脏祖细胞增殖中的作用。 方法:肝脏祖细胞进行体外原代培养时,实验组培养液中加入选择性C-Met磷酸化抑制剂Su11274,应用MTT比色法检测细胞增殖能力变化,通过实时定量RT-PCR和Western blot观察PI3K/AKT、STAT3和ERK1的mRNA和蛋白表达水平变化。 结果:Su11274浓度为2μM,肝脏祖细胞增殖开始出现明显减缓。实验组和对照组c-Met、PI3K、AKT、 STAT3和ERK1mRNA都有表达而且表达水平无明显差异。对照组c-Met蛋白在培养第6d开始上调,在第6d、8d、10d、12d、14d分别为1.250.29、1.560.22、1.590.30、1.610.27、1.600.28;p-c-Met蛋白第6d、8d、10d、12d、14d分别为0.820.25、1.160.27、1.150.24、1.150.29、1.160.22。实验组c-Met蛋白与对照组相比无统计学差异(P=0.71);p-c-Met蛋白第8d、10d、12d、14d分别为0.450.12、0.360.10、0.220.08、0.130.03,与对照组相比明显下调(P=0.026)。实验组和对照组PI3K、AKT蛋白表达无明显变化(P=0.65,P=0.73)实验组p-PI3K蛋白第10d、12d、14d分别为1.360.14、1.280.15、1.140.14;p-AKT蛋白第10d、12d、14d分别为0.360.11、0.310.09、0.220.11,与对照组相比存在差异(P=0.033,P=0.014)。对照组STAT3蛋白表达在第6d、8d、10d、12d、14d分别为0.530.14、0.490.13、0.430.12、0.420.10、0.430.11。实验组STAT3蛋白表达在第6d、8d、10d、12d、14d分别为0.520.13、0.470.11、0.420.09、0.400.12、0.410.10,与对照组变化相似(P=0.73)。对照组p-STAT3蛋白第6d、8d、10d、12d、14d分别为0.220.11、0.180.06、0.130.05、0.130.07、0.130.05,实验组p-STAT3第6d、8d、10d、12d、14d分别为0.220.08、0.170.05、0.150.05、0.110.07、0.060.02,两组存在差异(P0.001)。对照组ERK1蛋白,在培养的第6d表达水平开始上调,第6d、8d、10d、12d、14d分别为0.670.12、0.730.16、0.760.15、0.780.12、0.820.13,实验组ERK1蛋白表达变化与对照组一致(P=0.57)。对照组和实验组p-ERK1蛋白表达均从第6d开始增加,两组相比无统计学差异(P=0.81)。 结论:PI3K/AKT、STAT3可能是肝脏祖细胞的增殖阶段HGF/c-Met的相关下游信号。


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1 臧金锋;HGF/c-Met相关信号通路在大鼠肝脏祖细胞增殖中的作用[D];苏州大学;2014年
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