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柞蚕丝素作为VEGF165-Ang-1双基因共表达质粒传递载体的研究

麻彩丽  
【摘要】:工程化组织的血管再生问题是组织工程面临的关键挑战。在三维支架内复合促进血管再生的生长因子基因是解决这一问题的重要途径。VEGF(主要是VEGF165)和Ang(主要是Ang-1)是两种最重要的且仅以血管内皮细胞为靶细胞的促血管再生生长因子,在新血管的形成中扮演着关键的角色,但它们在体内易被代谢、失活,半衰期短。若能采用适当的基因传递载体装载外源性VEGF和Ang基因,并装载到三维支架上,生长因子能稳定、持续、高效地转染周围细胞并持续表达、分泌相关的生长因子,则能克服在支架内直接复合生长因子半衰期短的缺陷。而在基因传递系统中,基因传递载体对转染效率起决定性作用。PEI作为非病毒载体的典型代表,具有质子海绵效应,转染效率较高。但PEI所带正电荷的密度很高,细胞毒性较大,且不能被生物降解。柞蚕丝素是一种具有良好细胞相容性、生物活性和可降解性的蛋白质,且含RGD序列,可以通过受体介导作用特异性粘附细胞,并可能进而被细胞内吞。带负电荷的柞蚕丝素可以与带正电荷的PEI复合作为pDNA的传递载体,共同包被VEGF165和Ang-1双基因共表达质粒,降低PEI的细胞毒性,提高转染效率。 本文研究柞蚕丝素蛋白和PEI共同作为VEGF165和Ang-1双基因共表达质粒(用GFP作为报告基因)的传递载体对EA.hy926细胞的转染效率及细胞毒性的影响,寻找最佳的复合物制备方案,并将ASF/PEI/DNA复合物装载到丝素蛋白多孔支架上考察其对EA.hy926细胞的体外转染效率,以及在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型中对血管形成的促进作用。 首先,初步探讨了ASF/PEI/DNA转染EA.hy926细胞的效率。用ASF/PEI/DNA复合物转染EA.hy926细胞并进行激光共聚焦观察和流式细胞仪GFP阳性细胞比率检测。结果表明, ASF/PEI/DNA (60/3/2)组明显地比ASF/PEI/DNA (30/3/2)组和ASF/PEI/DNA(90/3/2)组转染效率高,但比ASF/PEI/DNA(120/3/2)组低。 然后,研究了ASF/PEI/DNA三者比例对细胞转染及细胞毒性的影响,寻找最佳的复合物制备方案。结果表明,当PEI/DNA质量比为10μg/2μg时,ASF/PEI/DNA复合物中加大ASF所占的质量比对转染效率的影响较小。MTT法检测PEI/DNA不同质量比对EA.hy926细胞毒性的影响,结果表明,当PEI与DNA的相对质量比分别为3/2,5/1,3/1时,随着绝对质量的增加,细胞存活率下降,细胞毒性增大。不同浓度ASF溶液以及不同质量比的ASF/PEI/DNA对EA.hy926细胞毒性影响的MTT测试结果表明,当ASF的浓度为5μg/μL时,ASF/PEI/DNA(60/10/2)的细胞存活率较高。用流式细胞仪定量检测GFP阳性细胞比率结果表明,当ASF/PEI/DNA的质量比为60/3/2时,转染效率相对较高。 最后,在丝素支架内装载ASF/PEI/DNA(60/10/2)复合物研究其体外转染效果。用CM-DiL和SEM观察二维培养细胞在支架内的分布情况;用DAPI染核和CM-DiL活细胞染色剂观察三维培养细胞在支架中的粘附生长情况。结果显示,二维培养条件下,在材料的内部和表面均可观察到大量的细胞,且细胞在支架中能比较充分地铺展;三维培养细胞至3d时细胞数量比1d时少了,但在随后7、9和14d时细胞数量呈明显的增多趋势。将包裹含GFP报告基因的质粒DNA的复合物装载到支架上转染细胞,结果在支架中可以观察到发荧光的细胞。ASF/PEI/DNA(60/10/2)复合物对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)的血管生成的促进作用的结果表明,装载VEGF165-Ang-1双基因的丝素蛋白多孔支架比装载VEGF165或Ang-1单基因的多孔支架生成的血管更丰富,呈弥漫、放射状血管形成。说明用ASF与PEI联合包被VEGF165和Ang-1双基因共表达载体质粒,不仅细胞毒性较低,且VEGF165-Ang-1双基因共表达质粒转染细胞后可以正常地表达、分泌相应的生长因子,从而促进血管形成。 本文不仅较系统地研究了ASF/PEI/DNA复合物中三者质量比对转染效率和细胞毒性的影响,而且首次研究了ASF与PEI联合包被含VEGF165-Ang-1双基因共表达载体的质粒DNA装载到丝素多孔支架中后转染细胞的效率及促进血管生成的效果。研究表明,ASF/PEI/DNA(60/10/2)是最佳的复合物,其转染效率以及细胞存活率均较高,并且在CAM模型中可以观察到此复合物对血管生成有明显的促进作用。


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