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草鱼白细胞介素1β的克隆及其在肠道炎症中的功能鉴定

卜云璇  
【摘要】:目的:白细胞介素-1β(IL-1β)是一种促炎细胞因子,主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生,可参与机体的多种生理及病理反应,在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等过程中发挥重要作用。草鱼是我国重要的淡水养殖经济鱼类,但其易遭受多种病原菌和病毒的危害,病原生物通常通过肠道进入草鱼体内,使其发生炎症乃至死亡,造成经济损失。本研究旨在通过克隆草鱼IL-1β基因,分析其基因结构,明确其在草鱼生理及病理条件下的各组织的表达水平,揭示该基因在肠道炎症发生过程中的可能作用。方法:运用RACE技术从草鱼中克隆IL-1β全长c DNA,通过p ET32a(+)原核表达系统表达IL-1β融合蛋白,并经镍柱纯化获得具有生物活性的蛋白。运用q PCR技术分别检测:(1)健康草鱼各组织的IL-1β转录水平;(2)用细菌内毒素(LPS)腹腔注射草鱼后4 h,12 h,24 h和48 h时各组织中IL-1β相对表达量。(3)肛灌不同剂量重组IL-1β活性蛋白后炎症发生过程中肠道组织内的IL-1β、IL-1R2和TNF-α基因相对表达水平。以割胶纯化的草鱼IL-1β重组蛋白为免疫原,制备草鱼IL-1β多克隆抗体,用琼脂双扩散法检测抗体的效价、Western blot验证其特异性。采用肛灌嗜水气单胞菌诱导草鱼产生肠道炎症,诱导12 h后肛灌20 ng/尾的草鱼IL-1β多克隆抗体(rgc IL-1βp Ab),用q PCR检测肠组织中IL-1β、IL-1R2和TNF-α基因在肠炎发生过程中的表达变化。采用免疫组化技术观察多抗处理3 d后草鱼肠道内天然IL-1β蛋白分泌特征。结果:草鱼IL-1?c DNA全长为1260 bp,包含一个813 bp的开放阅读框,编码长度为270个氨基酸的多肽,预测的分子量为30.1 k Da,氨基酸序列具有IL-1家族特征性序列,但缺乏哺乳动物中保守的典型IL-1?转换酶裂解位点。草鱼IL-1?基因组DNA长2863 bp,由7个外显子和6个内含子构成。系统进化树分析结果显示,草鱼和其他鲤科鱼类的IL-1?归为单独的一支。健康草鱼肌肉、肝脏、肠道、皮肤、鳍、心脏、脑、体肾、头肾、鳃和脾脏等11种组织中均有IL-1?表达,脾脏、鳃、头肾和体肾中其转录水平相较其他组织高,经LPS刺激鱼体后,IL-1β转录水平在肌肉、肝脏、肠道、皮肤、体肾、头肾和鳃中显著上调;其中,肌肉、皮肤、鳍和脾脏四种组织的IL-1β表达在12 h时上调至最高后随即下降,而另外6种组织在24 h时上调至最高,随后下降。不同浓度的草鱼IL-1β活性重组蛋白灌肠后,IL-1βm RNA水平显著上调,在刺激24 h时达到最高,且5μg/尾鱼剂量表达量最高,72 h时则下降;相应的,受体基因IL-1R2及下游基因TNF-αm RNA的表达也上调,其变化趋势与IL-1β基本一致。琼脂双扩散显示,所获多抗的效价为1:32;Western blot结果显示,所制备的多克隆抗体可特异性识别草鱼IL-1β蛋白。用嗜水气单胞菌肛灌诱导的草鱼肠道炎症12 h后肛灌草鱼IL-1β多克隆抗体,可降低IL-1β、IL-1R2及TNF-αm RNA的表达,减少肠道中IL-1β蛋白分泌量,减轻肠道炎症。结论:我们克隆并鉴定了草鱼IL-1β。该研究证实,该基因在草鱼体内呈组成型表达,IL-1β重组活性蛋白可诱导草鱼发生肠道炎症,其多克隆抗体可部分阻断肠道炎症。因此,IL-1β在草鱼肠道炎症的发生过程中发挥重要作用。


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