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TGF-β经典信号通路及相关基因调控非小细胞肺癌细胞上皮—间充质转化和侵袭转移机制研究

杨海平  
【摘要】:第一部分Ski抑制TGF-β/SMAD经典信号通路诱导的非小细胞肺癌细胞上皮-间充质转化和侵袭背景:上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肿瘤转移过程中发生的一项关键事件。在此过程中,伴随着上皮细胞分子标志物E-cadherin的表达减少和间质细胞分子标记物N-cadherin的表达增多,肿瘤细胞向间充质细胞形态发生变化,能动性和侵袭能力显著增强,具有明显的间充质细胞的特性。在多种癌症中,TGF-p信号通路都是一个诱发EMT的关键因素。Ski是TGF-β信号通路的一个重要的负调控因子,其可以与SMAD蛋白相互作用来抑制TGF-β信号通路。尽管越来越多的研究证实Ski在人类多种癌症中扮演着癌基因或抑癌基因的双重角色,但是在非小细胞肺癌中,Ski能否影响TGF-β诱导的EMT和肿瘤细胞侵润及其分子机制还没有研究进行详细的阐述。方法:(1)检测Ski在不同非小细胞肺癌细胞株和组织中的表达;(2)构建Ski过表达和敲弱的A549稳转细胞株;(3)在稳转细胞株中外源加入TGF-β1,观察细胞形态,Western blot检测EMT分子标记物E-cadherin和N-cadherin,以及p-SMAD3和SMAD3的表达;(4)构建含有PAI-1基因启动子区的荧光素酶报告载体转染稳转细胞株,在外源TGF-β1刺激下,检测其荧光素酶活性。(5)在外源TGF-β1刺激下,Transwell侵袭实验探究Ski对肺癌细胞侵袭能力的影响;同时real-time PCR检测MMP-2的表达。结果:与非转移性的非小细胞肺癌细胞株和癌组织相比,Ski在转移性的非小细胞肺癌细胞和组织中表达量是明显降低的;在外源TGF-β1刺激下,Ski敲弱的A549细胞株表现出更加明显的EMT变化和更强的侵袭能力,Ski过表达的A549细胞株则相反;Ski敲弱的A549细胞株中p-SMAD3的表达量升高,过表达的A549细胞株降低:PAI-1启动子区荧光素酶报告基因实验也同样证实Ski可以明显抑制TGF-β1信号通路的活性;当用特异性的SMAD3磷酸化抑制剂SIS3预处理细胞后,Ski对TGF-β诱导的EMT和细胞侵袭没有产生明显的影响。结论:我们的研究显示Ski抑制TGF-β1诱导的EMT和细胞侵袭,重要的是Ski的这种作用主要依赖于SMAD经典通路。Ski可能为肿瘤的诊断和治疗提供新的靶点。Ski对TGF-β诱导的EMT和细胞侵袭没有产生明显的影响。第二部分非小细胞肺癌中TGF-β激活的SMAD3/4复合体转录调控N-cadherin表达的机制研究背景:上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是发生在肿瘤转移早期阶段的关键过程。在多种癌症类型中,TGF-β信号通路通过抑制上皮标志物E-cadheirn的表达以及上调间充质标志物N-cadheirn来促使上皮细胞发生EMT。尽管许多的研究致力于E-cadherin的表达调控,但是在TGF-β介导的EMT发生过程中,N-cadheirn所受的直接性的转录调控却并不清楚。我们的研究是在TGF-β能够诱导N-cadheirn表达的非小细胞肺癌细胞株中,探讨TGF-β调控N-cadheirn表达的详细的分子机制。方法(1) Western blot and qRT-PCR分析在外源TGF-β1刺激下,不同NSCLC细胞株中N-cadherin的表达情况;(2)构建含有不同N-cadherin基因启动子区段的重组质粒,鉴定TGF-β1的应答效应区域;(3)染色质免疫共沉淀实验研究转录因子与CDH2启动子区的结合;(4)利用RNA干扰实验分析转录因子对N-cadherin表达的影响;(5)在非小细胞肺癌组织里进行相关性分析。结果:在A549, SPC-A1和H1650细胞株中,外源性的TGF-β1都能够诱导N-cadherin的表达;荧光素酶报告基因分析显示CDH2-1078/-891启动子区段存在TGF-β的应答效应片段;外源加入TGF-β1,瞬时干扰SMAD3或SMAD4导致CDH2启动子区的转录活性明显减弱;在A549和SPC-A1细胞株中,沉默SMAD3或SMAD4明显抑制CDH2的表达;在非小细胞肺癌组织中,SMAD3和SMAD4的表达和CDH2明显呈正相关的。结论:我们发现TGF-β活化的SMAD3/4转录功能复合体能够特异性与CDH2启动子区的SMAD结合原件结合,从而调控CDH2的表达;我们的研究阐述了TGF-β诱导EMT过程中调控CDH2表达的转录调控机制,为非小细胞肺癌SMAD依赖性的诊断干预治疗提供新的思路。


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