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新型线粒体靶向性铂类化合物的抗细胞增殖和抑制细胞迁移的研究

李菁玲  
【摘要】:目的:继顺铂问世以来,人们合成了数千种类似的铂化合物,其中大约30种进入临床试验阶段,不足10种获得上市,但在临床上得到广泛应用的只有3种,分别是卡铂、奈达铂和奥沙利铂。目前,亚细胞靶向性的铂类配合物成为研究热点,研究作用于细胞核DNA以外的其它位置是否可以提高抗癌药的效果。线粒体是真核细胞生存不可或缺的,它在细胞的生理和病理中发挥了重要作用,其中包括通过氧化磷酸化产生ATP,当细胞受到损伤时,可以激活体内的凋亡和坏死途径。由于线粒体可以调节细胞的基本功能,所以线粒体功能失调与肿瘤发生和预后有很大关系。实际上,正常细胞和肿瘤细胞的线粒体在结构和功能上有所不同,因为肿瘤细胞的代谢比较旺盛,所以肿瘤细胞比正常细胞更易受到线粒体干扰。线粒体靶向性的抗癌药在提高治疗效果方面成为一大热点,它可以产生较少耐药性和抑制细胞迁移。本实验室成功合成一类线粒体靶向性的铂类化合物,其杀死肿瘤细胞的效果明显高于传统药物顺铂,但是对肿瘤细胞的其他生物学效应尚未进行研究。本研究旨在通过对肿瘤细胞的生物学效应和对肿瘤细胞迁移和侵袭方面影响的研究,希望找到抗癌效果强,但对正常细胞毒性小,而且能够抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭的抗癌药物。材料与方法:本课题组成功合成几种线粒体靶向性的新型铂类化合物,与顺铂作用于细胞核DNA不同,我们合成的铂类化合物与线粒体DNA结合,由于线粒体中的DNA缺乏组蛋白和核苷酸切除修复途径,可以避免损伤的DNA被DNA修复系统修复,且我们的铂类化合物具有一定的空间结构,可以避免在与DNA结合前与含硫大分子结合,从而增加细胞内药物浓度,增强抗癌效果。本研究做了以下方面的工作:(1)细胞毒性实验(CCK-8),比较几种新型线粒体靶向性的铂类化合物Pt-platin与传统铂类化合物顺铂对肿瘤细胞(A549、HeLa、HepG2、MCF7)、正常细胞(MRC5)和耐顺铂的肺癌细胞(A549/DDP)的毒性;(2)体内肿瘤模型:雄性小鼠后背注入4TI细胞建立体内肿瘤模型,当肿瘤大小达到大约100mm3时,瘤内注射PIP-platin,连续观察30天,测量肿瘤大小,对照组注射PBS溶液;(3)以A549为细胞模型,PIP-platin为代表,流式细胞仪和电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)被用来检测药物在37℃不同时间或4℃时进入细胞的量;(4)为进一步研究药物内吞机制,在pip-platin处理细胞之前,用四种抑制剂:诺考达唑(nacodazole,微管抑制剂),氯丙嗪(chlorpromazine,抑制rhogtp酶),氯喹(chloroquine,抑制核内体酸化),布雷非德菌素a(brefeldin,抑制蛋白运输到高尔基体)预先处理细胞,然后用icp-ms检测进入细胞内的铂元素含量;(5)激光共聚焦显微镜观察pip-platin是否和线粒体共定位,以及提取细胞线粒体,分别检测细胞内总的内吞量和蛋白量、线粒体中的内吞量和蛋白量,进一步验证pip-platin是否主要聚集在线粒体中;(6)透射电子显微镜(tem)观察细胞加了pip-platin后线粒体的形态变化;(7)流式细胞仪检测药物作用后细胞周期和凋亡率的改变;(8)通过检测细胞内ros水平、线粒体膜电位的改变、atp的合成、细胞色素c的变化、细胞凋亡相关蛋白(bax,bcl-2)的表达,来研究药物对线粒体功能的影响;(9)另外,建立2d和3d细胞模型,利用细胞粘附实验、迁移实验、transwell技术来探讨pip-platin对细胞粘附、迁移、侵袭的影响;(10)荧光显微镜观察粘附相关蛋白?-catenin是否会聚集在细胞膜上;(11)westernblot检测粘附相关蛋白fak和p-fak表达量的改变;(12)研究pip-platin对wnt信号的影响,以及?-catenin蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核中的表达量。结果:细胞毒性实验表明新型线粒体靶向性的铂类化合物均能抑制细胞生长,具有剂量依赖性,对细胞的半数致死浓度(ic50)均小于顺铂,在所有的pt-platin中,pip-platin对正常细胞mrc-5的毒性(ic50=20.25?g/ml)比其他肿瘤细胞小(ic50=7-14?g/ml);pip-platin使体内肿瘤减小大约77%,p0.05,而pbs对照组肿瘤大小几乎没变化;流式细胞仪和icp-ms均显示随着时间增加,细胞内铂金属的含量随着增加,在4℃时内吞减少;nacodazole能抑制细胞内吞,而其它三种溶酶体抑制剂均未抑制内吞;激光共聚焦照片显示pip-platin能与线粒体共定位,pearson相关系数大于0.8,线粒体提取后,线粒体中的铂金属内吞量为0.99nmolpt/mg,大于细胞总的内吞量(0.35nmolpt/mg);tem结果显示5?g/mlpip-platin破坏细胞线粒体,使线粒体膜不完整,线粒体嵴减少;pip-platin处理细胞后,从5?g/ml开始,细胞内的ros水平比对照组明显增多,p0.05;pip-platin使线粒体膜电位降低、细胞内的atp合成减少、细胞色素c从线粒体释放到细胞质中、bax/bcl-2比例增加、细胞周期阻滞在s期;由凋亡实验可知,由pip-platin引起的细胞凋亡具有剂量和时间依赖性,但从20?g/m L开始才能引起明显的凋亡;2D模型中,我们发现,PIP-platin处理的细胞难以消化、粘附增加,划痕实验显示PIP-platin可抑制肿瘤细胞迁移,transwell实验显示加药组从transwell上室迁移到下室的细胞数减少,进一步证明PIP-platin可以抑制肿瘤细胞迁移和侵袭;3D细胞模型模拟了体内环境,结果表明,实验组的细胞球面积小于对照组,并与划痕实验及transwell的实验结果是一致的;荧光显微镜图片显示?-catenin在细胞膜聚集;FAK蛋白表达无明显变化,但是FAK磷酸化蛋白p-FAK蛋白表达情况有改变,先升高然后下降;PIP-platin抑制Wnt信号;PIP-platin使?-catenin在细胞膜上的量增加,但进入细胞核的量减少。结论:1.PIP-platin的毒性比经典抗癌药顺铂大,且对正常细胞毒性小。2.PIP-platin成功靶向到线粒体中,与线粒体共定位,破坏线粒体,使线粒体形态发生变化,比如:线粒体膜不完整、线粒体内嵴减少等。同时,PIP-platin可以导致线粒体功能受损,具体表现在:过量的活性氧、线粒体膜电位降低、ATP合成减少、细胞色素C从线粒体释放、Bax/Bcl-2的比例增加、在细胞周期的S期阻滞。3.PIP-platin增加细胞粘附、抑制细胞迁移和侵袭;PIP-platin影响粘附相关蛋白FAK和p-FAK表达;PIP-platin使?-catenin上膜,减少进入细胞核的数量,和抑制Wnt信号。


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