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长链非编码RNA在儿童急性白血病表达谱及其功能的初步研究

曹岚  
【摘要】:目的:长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)在基因调控中起重要作用,目前它对儿童急性白血病(Acute leukemia,AL)发病机制的影响尚不清楚。本研究采用微矩阵基因芯片技术,研究lnc RNA在AL患儿和正常儿童表达谱的差异;筛选一个差异最大的lnc RNA:AC002454.1,通过基因沉默技术对其进行功能的初步研究,为探索lnc RNA参与儿童AL发病的分子机制提供新的思路及实验基础。方法:1.对初治AL患儿9例,其中急性淋巴细胞性白血病(Acute lymphocytic leukemia,ALL)6例,急性髓细胞性白血病(Acute myelocyticleukemia,AML)3例;正常健康儿童9例。分为6个样本,AL患儿:L1(AML 3例)、L2(T-ALL 3例)、L3(B-ALL3例),正常对照:C1、C2、C3(各3例)。分别取骨髓/外周血单个核细胞,提取总RNA后进行质量测定。合格后杂交合成c DNA,经过Microarray基因芯片扫描仪扫描后得到原始数据,原始数据经过统计软件转换后进行统计分析,得到AL患儿与正常对照组之间lnc RNA和m RNA的差异表达谱。2.选取儿童AL中表达谱差异大于10倍以上的lnc RNA 97个,对21例ALL患儿、22例AML患儿及21例正常对照儿童,取骨髓单个核细胞,提取总RNA,并进行引物特异性逆转录成c DNA。采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR)技术,GAPDH做内参,循环阈值(Ct值)比较法进行lnc RNA表达定量分析,并与芯片结果验证。选其中差异最大的lnc RNA:AC002454.1分析其表达量与临床指标的关系。3.综合NCBI Ref Seq、UCSC、RNAdb、Lnc RNAs等数据库资源,对芯片结果进行Gene Ontology、Pathways等生物信息学分析,并通过计算Pearson相关系数建立lnc RNA与靶基因的基因网络图。4.选用白血病细胞株K562,NB4作为研究对象,构建并转染慢病毒载体下调AC002454.1表达,分别采用CCK8法、流式细胞仪技术、Western-blot等实验观察其对白血病细胞株增殖、凋亡、周期等生物学行为的影响以及CDK6表达的变化。结果:1.儿童AL差异表达的lnc RNA 2409个,其中上调2倍以上1394个,下调2倍以上1015个;差异表达的m RNA 2331个,其中上调2倍以上1073个,下调2倍以上1258个。儿童ALL差异表达的lnc RNA 1884个,其中上调2倍以上的1106个,下调2倍以上的778个;差异表达的m RNA 1857个,其中上调2倍以上905个,下调2倍以上952个。儿童AML差异表达的lnc RNA 4289个,其中上调2倍以上的2215个,下调2倍以上的2074个;差异表达的m RNA 4003个,其中上调2倍以上1769个,下调2倍以上2234个。2.q RT-PCR验证儿童AL差异大于10倍以上lnc RNA:ALL组显著上调9个(uc002ehu.1、AC002454.1、uc001guz.2、BC035649、uc001kpt.2、AK123765、NR_026776、NR_027182、ENST00000508489),显著下调7个(ENST00000415964、uc010arh.1、ENST00000457799、ENST00000511213、NR_002712、X61079、ENST00000417930);AML组中显著上调12个(AC002454.1、uc002ehu.1、ENST00000509150、uc001guz.2、ENST00000457457、uc001kpt.2、NR_027182、AK123765、BC031319、AK124936、uc003hhv.1、NR_026776),显著下调12个(AK027193、AK024584、BC005232、AK094982、uc003ebe.1、ENST00000512129、AF088004、uc002vje.1、uc010arh.1、ENST00000428188、ENST00000457799、ENST00000415964),结果与芯片一致。AC002454.1相对表达量与AL患儿性别、年龄、初诊时WBC计数、染色体、融合基因、危险度分层、预后等各项临床指标,无显著性差异(P值均0.05)。初诊AL患儿不同免疫分型的AC002454.1相对表达量差异显著(P0.05)。3.GO分析显示,上调的m RNA:413个参与生物学进程(Biological process)、90个参与细胞组件(Cellular component)、94个参与分子功能(Molecular function),分别以细胞周期(Cell cycle phase)、细胞内(Intracellular part)和催化活性(Catalytic activity)富集程度最高;下调m RNA:665个参与生物学进程、59个参与细胞组件、118个参与分子功能,分别以免疫反应(Immune response),质膜(Plasma membrane)和蛋白结合(Protein binding)富集程度最高。4.Pathway分析显示,24条基因通路受上调的m RNA调控,富集程度最高的是通路是细胞周期(Cell cycle),由26个目的基因组成;32条基因通路受下调的m RNA调控,富集程度最高的是通路是造血细胞系(Hematopoietic cell lineage),由23个目的基因组成。5.对表达差异显著的10个lnc RNA基因:ENST00000435695(AC002454.1)、ENST00000509150、NR_027182、AK124936、uc003hhv.1、AK027193、BC005232、ENST00000428188、ENST00000415964、NR_002712,通过计算与目的基因的Pearson相关系数(≥0.95),得到797个目的基因,并共同建立编码-非编码基因共表达网络(Coding-noncoding gene co-expression network)。6.下调AC002454.1表达可以抑制白血病细胞株K562和NB4的增殖(P0.05)、提高细胞凋亡率和延长NB4细胞细胞G2/M期。下调AC002454.1表达后K562细胞和NB4细胞的CDK6表达水平低于对照组。结论:1.本研究首次采用lnc RNA microarray基因芯片揭示儿童AL异常的lnc RNA表达谱,并对明显表达异常的lnc RNA采用q RT-PCR进行验证,结果与芯片一致。显示lnc RNA microarray基因芯片检测是一种理想高效的方法2.AL患儿lnc RNA表达与正常儿童存在明显差异,发现并确定了一个新的基因:AC002454.1在AL各型患儿中异常高表达,且表达量与AL患儿的免疫分型相关,可望成为儿童AL分型和判断预后的分子标记物。3.生物信息提示异常表达的lnc RNA、m RNA参与整个白血病细胞的多个生命过程及通路,调节细胞的转化和恶变,网络调控机制复杂。其本身以及它们参与调控的通路均有可能成为儿童AL基因干预治疗的新靶点。4.体外功能试验提示:下调AC002454.1表达可抑制白血病细胞的增殖能力、影响细胞周期和提高凋亡率;下调AC002454.1表达可影响CDK6表达,为进一步明确AC002454.1生物学功能、探索lnc RNA参与儿童AL发病的分子机制提供了新的思路和实验基础。


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